许娜 1;孙远征 1;李书霖 2;;; 

（1黑龙江中医药大学附属第二医院； 2.黑龙江中医药大学）

摘要：目的：观察夹脊电针对 ALS-SOD1G93A 小鼠发病及生存期的影响。方法：1、动物繁殖扩增及鉴定：于美国 Jackson 实验室引进遗传背景为 C57BL/6J 的hmSOD1G93A/+半合子雄鼠和 hmSOD1G93A阴性雌鼠，用于繁殖 hmSOD1G93A转基因阳性半合子小鼠。2、分组及处置：取雌性 ALS-SOD1G93A阳性小鼠 28 只，采用随机数字表法随机分配为夹脊电针（Electroacupuncture, EA）和模型对照组(Control)各 14 只，于小鼠 60 日龄开始，夹脊电针组针刺双侧 L1~2、L5~6 夹脊穴， 2Hz 电针治疗，20min/次，2 次/周。模型对照组给予与夹脊电针组同一时间，同一时长抓握、捆绑，20min/次，2 次/周。3、神经功能评分：采用悬尾试验进行神经功能评分，神经功能评分连续 2 天判定 1 分时记为发病期，神经功能评分达 4 分时记为生存期。4、行为学测试：采用转棒试验评价小鼠运动协调性及肌力。记录小鼠在转棒仪上的停留时间，记为潜伏期，最长潜伏期记为 180s。结果：1、子代 ALS-SOD1G93A小鼠鉴定：经 PCR 扩增后，部分泳道于 200-300bp 可见阳性条带，说明可成功繁育阳性 ALS-SOD1G93A小鼠。2、发病期生存期分析：夹脊电针组小鼠发病期（onset）比模型对照组推迟 9 天，差异显著，具有统计学意义（p＜0.01）；夹脊电针组小鼠生存期（survival time）较模型对照组延后 7 天，差异显著，具有统计学意义（p＜0.05）。Kaplan-Meier 生存分析可知，150 天开始，模型对照组小鼠存活率明显低于夹脊电针组。3、体重：从第 21 周开始，夹脊电针组体重明显高于模型对照组，差异具有统计学意义（p＜0.05）。4、行为学实验结果分析：从 16 周开始，模型对照组小鼠潜伏期开始下降，夹脊电针组从 17 周开始出现潜伏期下降，两组小鼠各阶段潜伏期比较结果发现，从 16 周开始，夹脊电针组潜伏期明显高于模型对照组，差异具有统计学意义（p＜0.05）。结论：夹脊电针可以延缓 ALS-SOD1G93A阳性小鼠发病，延长生存期，改善小鼠病程中运动功能。 

关键词：夹脊电针；肌萎缩侧索硬化；发病期；生存期 

Electroacupuncturing jiaji points prolongs the lifespan of ALS-SOD1G93A mice

XU Na1, SUN Yuan-zheng1, LI Shu-lin2 

(12nd Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese  Medicine,Harbin 150001,China; 2 Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040,China )

Abstract: Objective: Electroacupuncturing jiaji points(ex-b2) has been used in ALS patients clinically in China. Data shows that the motor funtion of ALS patient improved significantly by this therapy. To investigate the treatment effects, include onset, survival and motor function, etal., a control experiment was performanted to test the effects of electroacupuncture at jiaji points(ex-b2) of ALS SOD1G93A mice. Methods: ALS SOD1 G93A transgenic mice were treated by electroacupuncture at jiaji points (ex-b2) with the electrial stimulation at the frequency of 2HZ from the age of d60, 20min/time, 2 times/week for 4 weeks. The treatment effet was compared with the control group disposed by binding, seizing and nipping the mouse hair at the jiaji points(ex-b2) at the same time. In this study, we proceeded Tail Suspension Test, Turn-club Test to investigated the onset of the disease， survival time of the mice and motor function during the process of the disease, 2 times/week from the age of d60 to the end event occurrence. All the data obtained through aforementioned procedure was analyzed by the using of SPSS 17.0, gaussian distribution was test first for every group.Data which is in accordance with normal distribution proceeded with independent-samples t test subsequently, and data that is not conform to the normal distribution were going on with rank sum test. Results of the analysis presented as mean value±standard deviation；Kaplan-Meier Survival analysis was proceeded to analyze the survival datas. We setted p＜0.05 stands for the difference has significant meaning. Results: 1. Analysis of onset and survival time: EA group shows the delay of the onset of the disease for 9 days compared with the control group, the difference has significant meaning(p＜ 0.01)，and the EA group shows a prolong of the survival time of ALS mice for 7 days compared with the control group, the difference has significant meaning(p＜0.01).   2. Analysis of Weight:Data shows that mice weight of EA group was higher than that of the control group from the age of week21, difference has significant meaning(p＜0.05).   3. Analysis of Turn-club Test:residence time has declined since the mice age of week16 in control group, and since the mice age of week17 in EA group.residence time of EA group is significantly longer than that of the control group from the age of week16,difference has significant meaning(p＜0.05).  Conclusion: 1)Electroacupuncture at jiaji points（ex-b2）delays the onset of the disease and prolong the survival time of the ALS SOD1G93Atransgenic mice. 2)Electroacupuncture at jiaji points （ ex-b2 ） improve motor function of the ALS SOD1G93Atransgenic mice. 

Keywords: Electroacupuncture, Jiaji points(ex-b2), Amyotrophic lateral sclerosis, Survival time 

肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis , ALS)与癌症、艾滋病一同被认为是威胁人类生命的三大难治性疾病，该病起病隐匿，治疗手段匮乏，一旦发病多在 3-5 年内死亡。最新流行病学调查显示该病发病率为 3.13/100,000 人/年，患病率为 9.14/100,000 人/年[1]。目前唯一被 FDA 认可的治疗药物仅有 riluzole 一种，可以平均延长患者生存期 3 个月[2]，而且最新研究提示，该药仅在早期用药时存在延长生存期效应，连续用药 6 个月以上将会出现逆转性提高死亡率的不良结局[1]。导师根据多年临床经验，采用夹脊电针配合中药治疗肌萎缩侧索硬化症患者，可明显缓解患者肌无力症状[3]。这与国内其他学者采用夹脊穴治疗本病有异曲同工之妙[4]。本实验致力于夹脊电针干预 ALS 模型小鼠的有效性研究。为临床采用夹脊电针治疗本病提供理论基础，另外为进一步基础研究奠定理论基础。 

1实验动物 

1.1实验动物的繁殖与鉴定 

转基因 C57BL/6JhSOD1G93A基因型阳性小鼠，购于美国 Jackson 实验室，于中国农业科学院哈尔滨兽医动物研究所（恒温恒湿 SPF 级环境）繁殖扩增及基因鉴定。本实验程序均经过动物伦理委员会的审批。子代小鼠 30 天左右取足趾末节约 2mm，经 DNA 提取，PCR 扩增，PCR 结果分析，已知 hmSOD1G93A基因 PCR 产物长度为 236bp，以 IL-2 （长度在 300-400bp 之间）PCR 扩增结果为内参，根据电泳后是否出现介于 200-300bp 之间的 SOD1G93A条带，筛选出阳性子代小鼠。SOD1G93A基因应用 Jackson 提供的引物及方案进行 PCR 扩增鉴定。经统计，子代鼠中 SOD1G93A 基因阳性率为 40%±5%。SOD1G93A 转基因阳性小鼠在日龄 105 天左右开始出现悬尾试验阳性，即手持小鼠尾部，倒立位悬吊小鼠，观察小鼠双后肢的伸展及颤抖情况。随着日龄增长，于 120 天左右开始出现行动缓慢，后肢拖拽；随后逐渐出现腰以下及双下肢肌肉明显萎缩，体重减轻，155 天左右达终末期。 

针灸针规格：0.07mm×17mm，天津华鸿医材有限公司；长城牌 KWD-808 电麻仪，杭州丹顿医疗器械有限公司； 

1.2动物分组及干预方法 

分组方法  选用经 PCR 鉴定的 ALS-SODG93A 转基因阳性雌性小鼠共28 只，采用随机数字表法随机分为夹脊电针组和模型对照组各 14 只。 

各组干预 :从 60 日龄开始，每日观察小鼠精神状态，毛色，光泽度，及体重(g)。 

电针组：ALS-SODG93A转基因小鼠日龄 60 天开始进行针刺干预，选用杏林牌针灸针 0.17mm*7mm，针刺双侧 L1~2、L5~6 夹脊穴，依据《实验动物针灸手册》中小鼠穴位进行定位，取膀胱经第一侧线与督脉间中点，旁开背正中线 3mm 左右，L1~2 平肋脚下缘，L5~6 平髂嵴上缘。刺入皮下 4-5mm。同一组电极连于脊柱同侧，电极连接使电流方向与运动神经传导束方向一致，电针频率为 2HZ，电流大小以小鼠下肢肌肉收缩为度，1 次 20min，2 次/周，共治疗 4 周。 

模型组：ALS-SODG93A 转基因小鼠日龄 60 天开始予以与夹脊电针组同一时间，同一时长抓握、捆绑，2 次/周，共 4 周。 

1.3 生存期和行为学测试 

1.3.1 转棒试验：该测试用于评价运动协调性及小鼠肌力。转棒仪设置为

15r/min，记录ALS-SODG93A转基因小鼠在转棒仪上停留的时间记录为潜伏期，从小鼠日龄 60 天开始，每周 2 天进行转棒实验，实验前连续 5 天对小鼠进行适应性和学习训练。每只小鼠每天测三次，每次间隔 10min，记录停留时间最长的一次，最长潜伏期记 180s。 

3.2 神经功能评分:用于评定 ALS-SODG93A 转基因小鼠发病及疾病进展。每只鼠每周测 2 次。发病期：小鼠悬尾试验连续 2 天判定 1 分时记为发病时间点；生存期：待神经功能评分记为 4 分时，判定为终点事件，记录生存期。 

0分 悬尾时小鼠两后肢可完全伸展，偏离中线坚持 2s，反复 2~3 次； 

1分 后肢不能完全伸展偏离中线，或在悬尾时后肢震颤； 

2分 在行走 12inches(约 30cm)过程中，脚趾弯曲至少 2 次或拖拽后肢； 

3分 强直瘫痪或关节活动降低，前行时脚不可用； 

4分 侧倒时，小鼠在 20-30s 内不能翻身。 

1.4统计方法 

实验数据的录入及处理均采用 SPSS17.0 统计软件包进行处理，先进行正态检验，符合正态分布的数据用均数±标准差（