张宇佳１，李　双１，虞跃跃１，韩君萍１，赵　叶１，杨金华１，崔建美１

（1华北理工大学中医学院，唐山063000）

摘要：研究目的：探讨针刺对支气管哮喘大鼠肺组织Fibronection、CollagenⅠ表达的影响。研究方法：将30只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组和哮喘针刺组，每组10只。各组分别给予相应干预后，采用HE染色观察各组大鼠肺组织病理形态学改变，免疫组织化学染色法检测肺组织Fibronection、CollagenⅠ表达情况。研究结果：针刺可以有效改善哮喘大鼠肺组织病理改变，哮喘针刺组大鼠肺组织Fibronection、CollagenⅠ的表达均较哮喘模型组降低（F=32.408，P=0.000；F=15.861，P=0.000）。结论：针刺可降低哮喘大鼠肺组织中Fibronection、CollagenⅠ的过度表达以及改善哮喘大鼠肺组织的气道重塑程度。

关键词：针刺；支气管哮喘；纤维连接蛋白；Ⅰ型胶原蛋白

Effect of acupuncture on expression of Fibronection and CollagenⅠin lung tissues of asthmatic rats

ZHANG Yu-jia1, LI Shuang1, YU Yueyue1, HAN Junping1, ZHAO Ye1, YANG Jin-hua1, CUI Jian-mei

（1 College of TCM, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000)

Abstract: Objective: To explore the effects of acupuncture on the expression of Fibronection and CollagenⅠ in lung tissues of asthmatic rats. Methods: Thirty SPF male SD rats were randomly divided into normal control group, asthmatic model group and the acupuncture treatment group, with 10 rats in each group. Groups were given accordingly interventions, HE staining was applied to observe the morphologic changes of lung tissues; the immunohistochemical method was applied to test the protein expression of Fibronection and CollagenⅠ in lung tissue. Results: Acupuncture can effectively improve pathological changes of lung tissues in asthmatic rats. The expression of Fibronection and CollagenⅠ in lung tissue of acupuncture group significantly lower than asthmatic group(F=32.408，P=0.000；F=15.861，P=0.000). Conclusion:   Acupuncture could reduce the protein expression of Fibronection and CollagenⅠin lung tissues in asthmatic rats leading to airway remodeling.

Key words: Acupuncture, asthmatic, Fibronection, CollagenⅠ

       支气管哮喘是世界范围内严重影响人类身心健康的呼吸道慢性变态反应性疾病，全球约有3亿哮喘患者，我国大约有3000万哮喘患者，其发病率与死亡率在全球范围内呈逐年增高趋势[1-2]。西医治疗哮喘多以糖皮质激素吸入抗炎为主，疗效不甚满意。传统医学在治疗哮喘方面取得了丰富经验，且治疗方法多样，其中针刺治疗疗效显著，针刺治疗哮喘已有很长的历史，有良好的治疗作用、无副作用等优势，同时还可以减轻患者的经济负担，是适合长期应用的治疗手段[3]。本研究通过HE染色、免疫组织化学染色观察针刺对支气管哮喘大鼠肺组织病理改变及Fibronection、CollagenⅠ表达，来研究针刺对哮喘大鼠气道重塑的作用机制，从而为哮喘的防治提供新的途径。

1.材料与分组

1.1实验材料

       健康SPF级SD大鼠30只（购自天津市山川红实验动物科技有限公司，许可证号：

SYXK 2015-0038），雄性，体质量115g±10g，月龄4周。卵蛋白（OVA）（A5503-10G，美国Sigma公司）；兔抗大鼠Fibronection、CollagenⅠ第一抗体(ari-go)；Al(OH)3凝胶（天津欧博凯化工有限公司）；PV6000（K146819D，北京中杉桥生物有限公司)；DAB 染液（Kit -0031，福州迈新生物公司）；一次性针灸针（0.35×0.25mm，华佗牌）；雾化吸入器（085G3005，德国百瑞有限公司）；自制雾化罩。

1.2动物分组

30只SD大鼠计算机随机分为3组，每组10只：正常对照组（用生理盐水代替OVA）、哮喘模型组（按哮喘大鼠模型制备方法进行造模）、哮喘针刺组（“三穴五针法”针刺干预）。

2 方法

2.1 动物模型的建立

       在实验第1天模型组和针刺组大鼠腹腔注射生理盐水配制的卵蛋白（OVA）悬液1ml （含1 mgOVA +10 mgAl（OH）3），并于第8天重复注射1次。正常对照组SD大鼠腹腔注射1ml生理盐水，从第9天起哮喘模型组和哮喘针刺组用1%OVA混悬液雾化吸入激发，隔天1次，每次30 min，激发2周。正常对照组SD大鼠雾化吸入相应剂量的生理盐水，隔天1次，每次30 min，激发2周。

2.2 针刺方法

       自造模之日起开始针刺，穴位选取大椎（GV14）、双侧风门（BL12）、双侧肺俞（BL13），直刺，平补平泻手法，每5min行针1次（以200次/min捻针20次为行针1次），隔日针刺1次，共7次。

2.3 取材方法

       每只大鼠在完成末次雾化吸入结束24h内， 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.5ml/kg体质量），动物仰卧位固定在固定板上，取出右肺中叶，固定于4%的多聚甲醛24h后，将组织从固定液中取出，置于包埋筐中冲水（4-8h），消除甲醛的影响，常规梯度乙醇脱水、透明，石蜡包埋，肺组织连续切片，厚度为4μm。

2.4组织形态学观察

      将制备好的石蜡切片，放入二甲苯脱蜡，依次放入梯度酒精，纯水，苏木素染色10min，水洗3遍，盐酸乙醇分化10s，返蓝30min，至细胞核呈紫红色、细胞呈无色，依次过70%、80%、90%酒精乙醇各5min，95%酒精Ⅰ、Ⅱ各 5min，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察各组大鼠肺组织的形态学变化。

2.5免疫组织化学染色法检测Fibronection、CollagenⅠ在肺组织中的表达和分布

       将石蜡切片脱蜡至水，PBS洗涤5min×3次。微波盒中加入pH=6.0枸橼酸盐缓冲液，微波加热至沸腾，将石蜡切片放入，用中档微波处理10min后，取出微波盒，自然泠却，PBS洗涤5min×3次。滴加3% H2O2，室温下孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗5min×3次。滴加Fibronection、CollagenⅠ一抗（1:150），4℃过夜。PBS冲洗5min×3次。滴加二抗，室温孵育15分钟。PBS洗涤5min×3次。应用DAB显色，显微镜下发现有阳性表达后立即停止显色。苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察，扫图，使用Image-Pro Plus 6.0 软件测算平均积分光密度（IOD）。

2.6数据统计　　

      实验数据以均数±标准差进行描述，多样本均数比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），满足正态性和方差齐性时，两两比较采用LSD法检验；方差不齐时，选用Dunnett’S T3法检验，检验水准α=0.05。各组数据均用SPSS 17.0统计软件进行分析。

3.结果

3.1各组大鼠肺组织病理改变

       观察大鼠肺组织HE染色切片，正常对照组大鼠肺组织管腔光滑，管壁无明显增厚，气道粘膜无水肿，仅偶见极少量炎性细胞。哮喘模型组大鼠支气管管腔狭窄，气道壁不完整，气道内上皮细胞脱落，气道腔内粘液和炎性细胞分泌增多，肺泡隔增厚，气道平滑肌增厚。哮喘针刺组上述改变较模型组明显减轻，形态接近正常组（图1）。

3.2免疫组织化学法检测肺组织Fibronection表达结果

       免疫组织化学法染色后阳性表达呈棕黄色，主要位于肺泡腔中，以成纤维细胞周围表达维多。使用Image-Pro Plus 6.0软件测算各组大鼠肺组织的平均IOD值，哮喘模型组大鼠肺组织Fibronection水平较正常组明显升高（P=0.000，<0.05），经针刺干预后Fibronection水平较哮喘模型组明显降低（P=0.000，＜0.05），针刺组与正常组比较（P=0.655，＞0.05）（图 2，表 1）。

3.3免疫组织化学法检测肺组织CollagenⅠ表达结果

        免疫组织化学法染色后正常细胞核呈蓝色，CollagenⅠ阳性表达呈棕黄色，部位主要集中在气道平滑肌周围。使用Image-Pro Plus 6.0软件测算各组大鼠肺组织的平均IOD值，哮喘模型组大鼠肺组织CollagenⅠ 水平较正常组明显升高（P = 0.000，＜0.05），经针刺干预后CollagenⅠ水平较哮喘模型组明显降低（P=0. 000，＜0.05），针刺组与正常组比较（P =0.503，＞0.05）（图 3，表 2）。

4.讨论

       气道重塑是支气管哮喘的主要病理改变，是气道高反应性的病理基础，同时也是慢性哮喘反复发作的病理基础[4]。气道重塑的发生出现在整个哮喘病程。哮喘发作后通过适当的治疗能暂时控制症状，而气道重塑却呈持续进行性发展并逐渐加重，故防治气道重塑成为治疗哮喘的重点[5]。气道重塑的病理改变主要有杯状细胞增生、血管增生及重塑、平滑肌细胞增殖及肥大、上皮细胞缺失、粘液分泌增加、胶原沉积及上皮下组织纤维化[6]。而气道上皮下纤维化是其气道重塑的核心特征之一[7-8]，又称上皮下网状基底膜增厚，上皮下网状基底膜的增厚主要是由于肺成纤维细胞（FB）分泌的胶原纤维等细胞外基质沉积于基底膜[9]，成纤维细胞是气道粘膜下的主要成分之一，可以在气道黏膜下增殖和积聚、分泌细胞外基质，在气道重塑发生过程中起重要作用。它在炎性介质刺激下转变成肌成纤维细胞，而纤维连接蛋白（Fibronection）和I型胶原蛋白（CollagenⅠ）的主要来源就是肌成纤维细胞[10]。Fibronection、CollagenⅠ通过抑制降解基质的蛋白酶的表达，提高蛋白酶抑制剂的表达，调节具有促进细胞与细胞外基质相互作用的细胞外基质受体的表达，来促进细胞外基质的沉积[11]。CollagenⅠ被认为是气道重塑的早期标志，是体内含量最丰富也是分布最广泛的胶原，CollagenⅠ的沉积可以引起气道壁的增厚和僵硬[12]。Fibronection 是一种黏附性糖蛋白，其代谢变化发生较早，在CollagenⅠ合成之前就已经产生[13]，通过联结细胞和胶原从而介导细胞与细胞外基质间的反应、刺激成纤维细胞及上皮细胞等产生胶原和提高气道平滑肌细胞中RAS的表达水平来参与气道重塑[14]。

       针刺治疗支气管哮喘疗效肯定，能明显改善哮喘的临床症状，减轻炎症反应，缓解支气管痉挛，也对哮喘大鼠气道重塑有良好的调节作用[14-15]。本研究结果显示，HE染色镜下观察哮喘模型组大鼠肺组织气道重塑病理改变和炎症程度明显，且较正常对照组严重，经“三穴五针法”针刺后，病理改变及炎症程度均明显减轻。哮喘模型组肺组织中，Fibronection、CollagenⅠ表达显著增强（P＜0.05）；经针刺后Fibronection、CollagenⅠ表达明显降低（P＜0.05），差异具有统计学意义。哮喘针刺组Fibronection、CollagenⅠ表达含量趋近正常对照组，差异不具有统计学意义（P＞0.05）。哮喘模型组大鼠与正常对照组比较，气道重塑的程度与Fibronection、CollagenⅠ表达量的增高趋势一致，说明Fibronection、CollagenⅠ与支气管哮喘气道重塑的发生关系密切。造模后经针刺干预，改善了哮喘大鼠肺组织的病理形态及炎症程度，同时降低气道黏膜下及气道平滑肌中Fibronection、CollagenⅠ量的表达，表明“三穴五针法”针刺干预能有效缓解大鼠的哮喘发作，其作用机制可能是通过降低Fibronection、CollagenⅠ的表达，进而抑制网状基底膜胶原沉积及平滑肌层增厚，减轻气道炎症反应，缓解气道重塑实现目的的。但在防治哮喘过程中，针刺作为细胞外信号刺激通过哪条信号通路来实现对Fibronection、CollagenⅠ的调控作用仍需进一步实验深入研究。

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