针型氧传感器的研制及其在针刺起效作用机制中的应用前景

2018/07/24 09:39

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房钰鑫1(天津中医药大学针灸推拿学院实验针灸学研究中心，天津 300193)摘要：本文构建了一种新型连续、动态监测氧分压的针型氧传感器并对其在针刺起效作用机制研究中的应用前景进行展望。对针型氧传感器进行响应性能检测，结果表明所制备的传感针对氧分压具有较高灵敏度的电化学响应，且具备良好的重复性和稳定性。对进行在体穴位实时、动态氧分压检测奠定了很好的工作基础。有望解决生化物质在经穴分布的特异性、循经感传或针效产生过程中经络线上所发生的分子事件及其与针效的相关性、生化物质参与经络活动的过程及机制等问题，对中医经络腧穴研究具有重要的意义。关键词：氧传感针；微型传感器；氧分压；针刺起效；中医腧穴1．引言       氧是生物体进行新陈代谢的关键物质，是维持人和动植物生命活动必不可少的元素之一。通常情况下，氧分压（PO2）被用作是一种描述溶解氧浓度的重要参数，在医学研究、临床诊断记起他众多领域中广泛应用。目前测量PO2参数的方法较多，例如比色法(Suzuki, Nishide et al. 2000)、荧光法(Bailey, Cruickshank et al. 2003)、化学发光法(Freeman and Seitz 1981)等，但这些普遍存在操作繁琐、成本较高、延迟性等缺点。并且，随着生命科学的发展，参与生理活动的体内氧分压参数的监测越发重要，因此构建一种能够在体、实时、动态、连续监测氧分压的方法成为了科学家们需要攻克的主要难题。      针刺是中医学领域中的重要组成部分，它是通过刺入生物体内特定部位（即腧穴），并联合应用一定的操作手法，经过经络的针刺信号传导作用从而达到治疗疾病目的的特殊手段(Cheng 2014)。由于针刺疗法具有许多独特的优势，如适应性广泛、疗效迅速显著、操作方法简便易行、成本低廉、副作用少等(Beal 1999)，目前已传播至世界一百四十多个国家和地区，为保障全人类的生命健康发挥了巨大的作用。根据中医学理论，人体内主要由14条经脉线贯穿并连接着穴位及其相应的器官(Cheng 1987)。但是基于这些穴位和经脉线的解破学结构及生命物质尚不明确，因此在体原位检测穴位局部物理化学物质对进一步阐明针刺疗效机制具有重要的意义。      本文制备了能够实现实时、动态、连续监测的针型氧生物传感器，并对其进行体外性能指标的检测和评估；所制备的针型氧传感器对氧分压有良好的电催化响应性能，具有较高的灵敏度和良好的稳定性能，对进行在体穴位实时、动态氧分压检测奠定了很好的工作基础。2．实验部分2.1仪器、材料与试剂        LK3200型电化学工作站，天津市兰立科化学电子高技术有限公司；JB-1型磁力搅拌器，上海雷礠仪器厂新泾分厂；铜质漆包线（φ=0.16mm、0.71mm）、橡胶管（φ=3mm）、5号不锈钢注射针头、1200目砂纸、金相抛光布、手术刀片、竹签（φ=2mm）、302改性丙烯酸酯胶粘剂，天津华生源科技有限公司；        氯铂酸钾（Potassium hexachloroplatinate, K2PtCl6），Sigma；PBS（0.1 M），pH 7.2~7.6、氧化铝抛光粉（φ=1μm、0.5μm），天津华生源科技有限公司；氮气和氧气，天津市六方工业气体经销有限公司； 2.2 氧传感针的制备及其表面纳米铂颗粒的修饰2.2.1 材料准备（1）将长8cm铜质漆包线（φ=0.16mm）两端长5mm的绝缘漆刮除；取两段长3cm铜质漆包线（φ=0.71mm），一段绝缘漆全部刮除，另一段两端长约5mm绝缘漆刮除（引出工作电极之用）；取1cm长橡胶管（内径3mm）、8cm长竹签（φ=2mm）、5号不锈钢注射针头一支备用。（2）将上述准备好的材料先后用丙酮、0.5M H2SO4溶液、去离子水冲洗，晾干备用。（3）用0.1M PBS配置10 mM的K2PtCl6溶液备用。2.2.2电极组装       将铜质漆包线（φ=0.16mm）穿入5号不锈钢注射针内，其一端与铜质漆包线（φ=0.71mm）刮除绝缘漆端套于橡胶管内，引出工作电极连线。将绝缘漆全部刮除的铜线与不锈钢针壁贴合在一起，作为参比电极，用302改性丙烯酸酯胶粘剂将注射针两端密封固定，用万用表测试连接是否良好，保证非短路状态，注射针尖端沿截面削平，体视显微镜下观察露出铜截面。在砂纸和抛光布上进行打磨抛光，直至铜截面平整光滑。2.2.3电极表面的修饰（1）将电极用无水乙醇和去离子水反复冲洗后，在0.5M稀硫酸中-0.3~1.5V范围内进行循环伏安扫描，直至伏安曲线达到稳定状态，以除去电极表面的杂质。（2）将电极放入10 mM的K2PtCl6溶液中，在-0.2V条件下利用恒电位电解技术在电极表面电镀纳米铂颗粒，以增大电极比表面积、提高电子转移速率。2.2.4体外性能检测（1）氮、氧饱和PBS的制备：将N2和O2连续通入PBS中30min后即得到饱和氮、饱和氧溶液，其中饱和氧溶液中溶解氧的浓度为2.6 ×10-4 M(Ju and Shen 2001)（2）采用常规的三电极测试系统，以修饰了纳米铂颗粒的传感针作为工作电极，铂丝（直径1mm）作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，进行溶解氧电化学检测。2.2.5体内氧分压检测        选用SPF级健康成年雄性SD大鼠10只，体重160-180克，所有大鼠给以自然照明、饮水和饮食，在同等标准环境内适应性饲养1周。选取足三里（ST36）、上巨虚（ST37）、曲池（LI11）、内关（PC6）作为实验组，其旁开点（距离穴位1cm处）作为对照组，长时间在体监测穴位及其旁开点氧分压变化情况。3．结果与讨论3.1纳米铂在电极表面的电沉积研究<img src="/Public/uploads/image/20180724/1532396256130602.png" title="1532396256130602.png" alt="QQ截图20180724093408.png" width="352" height="226" style="width: 352px; height: 226px;"/>       图1表示传感针电极在-0.2V的恒定电位下，在10 mMK2PtCl6溶液中电沉积5 min 测得的电流随时间变化曲线。如图所示，所得到的曲线较为平整，说明在铜截面的电沉积过程比较稳定，这种方法能够制备出均一致密的纳米铂薄膜。<img src="/Public/uploads/image/20180724/1532396276101117.png" title="1532396276101117.png" alt="QQ截图20180724093421.png" width="418" height="165" style="width: 418px; height: 165px;"/>       图2为传感针电极表面在体式显微镜50倍放大条件下的图谱表征。从图2（a）可以看出，所制备的传感针电极表面打磨的比较光滑，这是检测电化学信号的先决条件。图2（b）为修饰有纳米铂颗粒的传感针电极表面表征图，可以清楚地看到在电极表面形成了一层均匀致密的纳米铂薄膜，这与上述纳米铂电沉积结果保持一致，充分说明该电极表面得到了良好的修饰，保证了后续实验的顺利进行。 3.2修饰有纳米铂薄膜的传感针对溶解氧电化学检测性能的研究       图3表示传感针表面修饰纳米铂前后在含氧和无氧状态下的电化学性能检测。从图A可以看出，当电极在氮气饱和PBS中进行循环伏安检测时，没出现任何的电流峰。而当在氧气饱和PBS中检测时，在-0.5V左右处出现了一个明显的还原峰，说明了所制备的传感针电极能够对溶解氧进行催化还原作用。根据文献报道(Kongkanand and Kuwabata 2003)，溶解氧在电极表面所发生的是一种快速的4-电子还原反应，反应式如下： <img src="/Public/uploads/image/20180724/1532396665451739.png" title="1532396665451739.png" alt="QQ截图20180724093435.png" width="395" height="247" style="width: 395px; height: 247px;"/><img src="/Public/uploads/image/20180724/1532396739716600.png" title="1532396739716600.png" alt="QQ截图20180724093443.png" width="444" height="288" style="width: 444px; height: 288px;"/>       从图B中可以看出溶解氧在裸铜电极和修饰有纳米铂的电极表面均发生了还原反应，但在修饰有纳米铂的电极表面的峰电流明显高于裸铜电极，这主要是由于纳米铂有增大比表面积和提高电子转移速率的作用，放大了对氧还原的响应信号，由此也证明在传感针表面电沉积铂纳米颗粒是有意义的。<img src="/Public/uploads/image/20180724/1532396930801292.png" title="1532396930801292.png" alt="QQ截图20180724094625.png" width="315" height="419" style="width: 315px; height: 419px;"/>图4 (A) 不同浓度溶解氧的循环伏安扫描图：(a)0.195 mM; (b) 0.13 mM; (c) 0.11 mM; (d) 0.0488 mM; (e) 0 mM. (B) 传感针对溶解氧检测的线性拟合工作曲线       图4表示修饰有纳米铂的传感针对不同浓度溶解氧的检测性能研究，从4A中可以看到，随着氧浓度逐渐增大，传感针对氧的峰电流响应也逐渐增大。根据4A中的循环伏安曲线，选取不同氧浓度的峰电流值与氧浓度进行线性关系分析，得到线性拟合工作曲线（如图4B），可以看到传感针对溶解氧的响应电流与氧浓度呈线性比例关系，线性相关系数（R2）为0.96，灵敏度为9.02μA/mM。因此根据此工作曲线便可以通过响应电流值而计算出待测溶解氧的含量。3.3 氧浓度检测的重复性研究       利用修饰有纳米铂的同一根传感针每天对饱和氧PBS进行循环伏安法检测，连续检测五天（每天测三次取平均值），如图5所示。五天峰电流值的相对标准偏差（RSD）为2.8%<img src="/Public/uploads/image/20180724/1532396965493268.png" title="1532396965493268.png" alt="QQ截图20180724093513.png" width="383" height="269" style="width: 383px; height: 269px;"/> 4 微型氧传感器在针刺起效作用机制中的应用前景       氧是维持人和动植物生命活动必不可少的元素之一。在生命科学领域，生物耗氧量(BOD)是研究生命活动的一项重要指标。随着生命科学的发展，参与生理活动的氧参数的研究越发显得重要。大量现代医学研究资料表明：检测机体组织中的氧分压在人体经穴研究、生理和病理学研究以及针刺起效作用机制研究等方面都具有重要的意义，能够为临床诊断与治疗提供有力的科学依据。       本研究所制备的针型氧传感器对氧分压有良好的电催化响应性能，具有较高的灵敏度和良好的稳定性能，对进行在体穴位实时、动态氧分压检测奠定了很好的工作基础。有望解决生化物质在经穴分布的特异性、循经感传或针效产生过程中经络线上所发生的分子事件及其与针效的相关性、生化物质参与经络活动的过程及机制等问题，对中医经络腧穴研究具有重要的意义。 参考文献Bailey, R. T., et al. (2003). "Characterization of a fluorescent sol-gel encapsulated erythrosin B dissolved oxygen sensor." Anal Chim Acta 487: 101-108.Beal, M. W. (1999). "Acupuncture and acupressure applications to women's reprocuctive health care." J. Nurse-Midwifery 44: 217-229.Cheng, K. J. (2014). "Neurobiological mechanisms of acupuncture for some common illnesses: a clinician's perspective." Journal of Acupuncture and Meridian Studies 7(3): 105-114.Cheng, X. (1987). "Acupuncture and Moxibustion." Revised Edition, Foreign Languages Press, Beijing, 1-3.Freeman, T. M. and W. R. Seitz (1981). "Oxygen probe based on tetrakis(alkylamino)ethylene chemiluminescence." Anal. Chem. 53: 98-102.Ju, H. X. and C. Z. Shen (2001). "Electrocatalytic reduction and determination of dissolved oxygen at a poly(nile blue) modified electrode." Electroanalysis 13: 8-9.Kongkanand, A. and S. Kuwabata (2003). "Oxygen reduction at silvermonolayer islands deposited on gold substrate." Electrochem. Commun. 5: 133-137.Suzuki, Y., et al. (2000). "Membranes of the picketfence cobalt prophyrin complexed with poly(vinylimidazole and pyridine)s: selective optical response to oxygen." Macromolecules 33: 2530-2534.