杨　沙134，樊小农135，罗　丁2，张亚男2，魏媛媛2，张海涛2，陈建飞2，贺妮娜2，常晓波2，王　舒134，孟智宏1，石学敏1

(1.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所,2.天津中医药大学,3.国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室,4.天津市针灸学重点实验室,5.国家中医药管理局量效关系三级实验室，天津 300193)

[摘  要] 目的：探讨慢频率下，不同针刺时间参数对内关穴经穴特异性的影响。方法：参照Zea-Longa线拴法复制大脑中动脉缺血模型（MCAO），随机分为基础组即正常组、假手术组、模型组、非针刺组以及内关短时间组（5秒）、中时间组（60秒）和长时间组（180秒）共七组，内关穴三组针刺参数是固定1次/秒频率分别应用5、60、180秒的针刺时间，并每12小时针刺一次持续6次。观察效应指标即动物神经功能情况、缺血局部微循环血流量、脑组织梗死率，和机理指标包括微循环血管输入枝、输出枝管径，以及脑组织HE染色的细胞形态学指标。模型组在造模成功即刻，后四组在造模后72小时观察指标。结果：内关三个组在效应指标的改善上优于模型组、非针刺组(P＜0.05)，机理指标中，内关皮层、海马、纹状体的微血管数、正常神经细胞数(P＜0.05)增加，对各项指标的改善，以中长时间较优。结论：针刺内关穴可获得较好效应，针刺时间可影响经穴效应，慢频率下应用较长针刺时间可相对获得更好效应；其内在作用机制可能是改善脑组织微循环状态、调节缺血后炎症反应，减轻神经细胞坏死。

[关键词] 内关；针刺时间；效应；MCAO

Study on the Influence of Different Time for Intervention on MCAo Rats by Stimulating Neiguan Acupoint with Slow Frequency 

Sha YANG, Xiaonong FAN, Ding LUO, Ya’nan ZHANG, Yuanyuan WEI, Haitao ZHANG, Jianfei CHEN, Nina HE, Xiaobo CHANG, Shu WANG, Zhihong MENG, Xuemin SHI 

Abstract: Objective:Study on the influence of different time for Intervention on MCAo Rats by stimulating Neiguan acupoint with slow frequency.

Methods: The rats subjected to MCAo with suture method by Zea-Longa were divided into seven with randomization:normal group, sham operation group, model group, the non-acupuncture group, as well as stimulating Neiguan acupoint for a short time (5 seconds) group,stimulating Neiguan acupoint for a moderate time (60 seconds) group,stimulating Neiguan acupoint for a long time (180 seconds) group.The parameters of the three groups with simulation on Neiguan acupoint are fixed as 1 / s,and the frequency is respectively 5,60,180 seconds acupuncture time, and acupuncture once every 12 hours lasting for 6 times. Observe the effect indicators of the animal nerve function, microcirculation blood flow in the ischemia local , infarction rate of the brain tissue and mechanism indicators, including the microcirculation vascular input branches, diameter of the output branches, as well as morphological indicators of the brain tissue HE staining cells.As for the model group observe the effect indicators as soon as modeling successfully.as for the other four groups,observe the effect indicators 72 hours after modeling.Results: the effect indicators improvement of the three groups with simulation on Neiguan acupoint is better than the model group, the non-acupuncture group (P <0.05),as for the mechanism indicators the cortex, hippocampus, striatum microvessel counts the number of normal nerve cells (P <0.05) increase, the improvement of the indicators in the long time group is better. Conclusion: acupuncture on the Neiguan acupoint can get better effects, the acupuncture time can affect the Meridian effect,slow frequency with longer acupuncture time can  relatively  get better effect; its intrinsic mechanism may improve brain tissue microcirculation, regulation inflammation after ischemia , and relieve nerve cell necrosis.

Keywords:Neiguan; the acupuncture time; effect; MCAO 

      特定经穴效应的产生受患者的身体状态、个体差异、针刺刺激强度等诸多种因素的影响。因此，会出现“疾病相同，但经穴效应不同”的情况，但是对于同一个病人，在已确定应用某种经穴“处方”的前提下，发挥经穴最大效应的直接手段，莫过于选择“最佳”针刺方法（针刺手法、刺激参数、刺激量……），就如同中、西药物剂量的调整。其中，针刺操作时间是最容易控制的[1]。为了研究针刺时间对经穴效应的影响及其内在机理，我们选取“醒脑开窍”针刺法主穴之一的内关穴，以1次/秒较慢频率下分别施以代表短、中、长时间的5秒、60秒、180秒三种针刺持续时间的刺激，比较MCAO大鼠在神经功能缺损评分、脑血流、脑梗死面积比率及不同部位脑组织切片光镜下细胞形态学指标上的差异。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

      1.1.1 主要试剂  水合氯醛(分析纯)；多聚甲醛(分析纯)；25%戊二醛；PBS溶液；TTC粉末；生理盐水；苏木伊红(以上均由天津市瑞金特化学品有限公司提供)；石蜡(上海华永石蜡有限公司)、无水酒精(天津市化学试剂三厂)、二甲苯(天津市北方化学试剂厂)。甲醛溶液(分析纯) (天津市化学试剂批发公司，天津市瑞科生物科技有限公司提供)。

      1.1.2 主要仪器  DRT4激光多普勒血流仪(英国Moor公司生产)；XW-4彩色微循环检测仪(合肥响石电子科技有限公司生产)；LEICATP1200脱水机、LEICAEG1150H包埋机、LEICAEG1150C冰台、LEICARM2245切片机(均由LEICA公司生产)；TP-C摊片机、TP-C烘片机(均由久圣医疗公司生产)；奥林巴斯光学显微镜；BencgMarkTM脑立体定位仪、STRONG 90牙科钻、摇床、电子天平、Olympus fe-240数码相机。

1.2 实验动物与分组

       1.2.1 实验动物  SPF级Wistar成年健康雄性大鼠，260g～280g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2007-0001。

       1.2.2 实验分组  以上大鼠共126只，随机分为正常组、假手术组、模型对照组、非针刺组和内关组。内关组中又随机分为短时间组、中时间组和长时间组，共有7组。

1.3 实验方法

      1.3.1 模型制备  参照Zea-Longa线拴法[2]复制大脑中动脉缺血模型（MCAO），主要步骤：禁食水12小时，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（350mg/kg）至动物对疼痛刺激反应消失为止，背位固定于大鼠手术板，局部消毒后备皮，取颈部正中稍偏左切口2～2.5 cm，分离二侧甲状腺,暴露左侧胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌间的三角区，钝性分离左侧颈总动脉和颈外动脉，并用0号手术线结扎颈外动脉。在分叉处和近心端处分别用小动脉夹夹闭一段颈总动脉，然后用1ml注射器针头在近心端处扎一个小孔，用0.260mm的鱼线缓慢插入，待插进之后，放开分叉处的动脉夹，将鱼线继续进入颈内动脉，直至遇到阻力为止，鱼线进入颅内深度为18-20mm，此时插入的鱼线正好封闭大脑中动脉开口，阻断大脑中动脉的血流。插线成功后结扎颈总动脉及针孔处，放开另一个动脉夹，清洗并分层缝合。

      1.3.2 造模成功判定  大鼠造模清醒后，按Zausinger六分法[3]对其神经功能进行评分，去除未造模成功及病情过轻过重的模型，即评分为0、4和5分的动物。

      1.3.3 针刺方法  （1）内关穴定位参照李忠仁《实验针灸学》[4]：内关经穴于前肢内侧离腕关节约3mm左右的尺桡骨缝间。造模成功后待大鼠清醒，约一个小时左右，即给予第一次针刺干预，固定针刺频率为1 次/秒，短、中、长时间组刺激时间分别为5秒、60秒、180秒，之后每间隔12小时同样方法干预一次，72小时共干预6次。（2）非针刺组：造模成功后在相应时间段内，用与针刺组实施同等条件的抓取，但不实施任何针刺干预，共抓取6次。（3）模型对照组：造模成功后，待大鼠完全清醒，不实施任何针刺，立即给予各项指标的测定。（4）正常组、假手术组：不实施造模手术及针刺干预，但也同等条件抓取，同样抓取6次。

      1.3.4 观察指标及方法  （1）神经功能缺损评分（即行为学评分）：于造模成功时及72小时按Zausinger六分法进行评定。具体方法同前。（2）脑血流量和微循环管径的测定：将大鼠麻醉后，以前囟为原点，移动立体定位仪，纵向向大鼠后方移动3mm，横向向大鼠患侧(即左侧)移动1mm，在该点用激光多普勒仪测定数据，用鼠标选取平稳后1min的那段曲线，按软件操作程序进行报告分析，最后导入到excel输出保存。在测定脑血流量的点上用牙科钻打一个直径约5mm的孔，然后用XW-4彩色微循环检测仪拍照，用软件记录和分析所得图像数据。（3）脑组织梗死灶体积测定(TTC染色)方法：干预结束后，大鼠断头处死。2 min内取出大脑，用0℃生理盐水冲洗并以滤纸吸干表面水分，于-20℃冰箱冷冻20min后取出，去除嗅球、脑干及小脑，放置到大鼠脑组织切片机，自前脑额极起，连续切出5片冠状切片，片厚2 mm，将脑片置入1% TTC染色液中，37℃避光孵育30 min，中间一次翻面。用数码相机摄下脑片，脑片两面各拍摄两张备用，后用计算机病理图像分析系统，计算脑梗死面积百分比。（4）光镜观察脑组织HE染色切片计数微血管数、正常、坏死神经细胞数、炎性细胞数并计算神经细胞坏死率：将鼠脑取出后放置于12%的甲醛溶液中固定，选取额叶皮层、海马、纹状体三部位，改刀后分别放入PBS溶液中洗涤4次，置于脱水机中脱水24h；脱水后用石蜡包埋；切片机切片厚度5μm，在去离子水中摊片，再用干净的载玻片捞起，二甲苯脱蜡、酒精水化后依次用苏木精和伊红染色最后用树脂封片；用光镜观察，在400倍视野观察计数微血管数、炎性细胞数、正常神经细胞数和坏死神经细胞数（神经细胞坏死率为坏死的神经细胞与正常神经细胞数比值）。各实验组共有12张切片，即每组6只动物样本，每样本每个部位切片两张，每张切片观察两个视野取其平均值记录。

1.4 统计方法

      采用SPSS17.0软件包，先进行数据正态性检验，若系正态分布则用单因素方差分析；如为偏态分布，选用秩和检验。运用单因素方差分析统计法。检验水准为α=0.05，若方差齐性检验，方差不齐时选用Dunnett T2检验进行两两比较，如果方差齐，则选用LSD检验。

2 结果

2.1 不同针刺时间对内关穴干预MCAO大鼠效应的影响

      见表1。在效应指标中，假手术组与正常组比较，神经功能缺损评分、脑血流量轻度下降，脑梗死率无增长，均无统计学差别(P＞0.05)，表明造模时手术操作对观察指标未造成实质影响；模型组、非针刺组神经功能缺损评分、脑血流量明显低于假手术组(P＜0.05)，脑梗死率明显高于假手术组(P＜0.05)；而非针刺组则在神经功能缺损评分(P＜0.05)、脑血流量结果高于模型组(P＞0.05)，脑梗死率低于模型组(P＞0.05)，说明脑梗死发生后鼠有向愈趋势。在慢频率下，内关各组的效应有随针刺时间的延长而增效的表现：神经功能指标短、中、长时间下均有改善（与模型组比较P＜0.05，但与非针刺组比较P＞0.05），以中时间改善效应较好；脑血流量呈递增趋势（中、长时间组与模型组和非针刺组比较均P＜0.05）；对脑梗死率由大到小的时间顺序依次为长-中-短（长时间组与模型组比较P＜0.05），说明中、长时间刺激内关穴可增加脑血流量减小脑梗死率，有效改善神经功能缺损评分。

2.2 不同针刺时间对内关穴干预MCAO大鼠效应影响的机制研究

（1）对微循环的影响（见表2）

      各组输入支、输出支管径的变化趋势一致。模型组大鼠微血管管径较正常组、假手术组明显收缩(P＜0.05)，非针刺组微循环管径较模型组扩张明显(P＜0.05)；相对于基础组，内关穴各组均表现出“适度”而非一味地扩张微血管管径，充分体现了经穴对机体机能的特异性调整作用。

（2）对脑皮层的影响（见表3）

       结果显示，MCAO模型大鼠皮层出现神经细胞坏死和炎性反应，经过72小时（非针刺组）皮层的神经细胞坏死未加重，而炎性反应明显加强，对微循环的影响不大。针刺内关穴可抑制皮层神经细胞坏死，抑制或控制过度激烈的炎性反应（短时间组低于模型组，中、长时间组炎性细胞数低于非针刺组），明显改善了微循环（微血管数增多）。

      结果显示，MCAO模型大鼠海马出现微循环障碍、神经细胞坏死和炎性反应，经过72小时（非针刺组）海马炎性反应进一步加强，而微循环明显改善，神经细胞坏死得到遏制。短、长时间针刺内关穴均可改善微循环、抑制神经细胞坏死和炎性反应（短时间组改善微循环更显著，长时间组抑制神经细胞坏死更明显）；中时间组可改善微循环，但炎性反应仍较强，神经细胞坏死无减轻（炎性细胞数和神经细胞坏死率均与非针刺组近似）。

（4）对脑纹状体的影响（见表5）

      结果显示，MCAO模型大鼠纹状体出现微循环障碍、神经细胞坏死和炎性反应，经过72小时（非针刺组）虽然纹状体神经细胞坏死和炎性反应得到遏制，但微循环障碍进一步加重。针刺内关穴明显改善纹状体微循环（尤以短时间组明显），抑制神经细胞坏死，但炎性反应进一步加强（中、长时间组）。

       综合以上三个部位研究结果，基础组在皮层、海马、纹状体光镜下形态学均表现出一致的趋势：模型组与正常组、假手术组比较，神经细胞坏死率升高(P＜0.05)，微血管数减少，炎性细胞数增加；非针刺组与模型组比较，坏死率降低(P＜0.05)，微血管数减少(P＜0.05)，炎性细胞数减少。表明大脑中动脉梗死后，脑血流量减少，脑组织发生了微循环障碍、神经细胞坏死和炎性反应等广泛的病理变化，从而影响神经功能；不予治疗，72小时后，MCAO大鼠神经功能有所改善，提示生物具有自我修复能力，可能主要表现为遏制纹状体炎性反应和海马、纹状体的神经细胞坏死，改善海马微循环；另外，皮层、海马的炎性反应加强、纹状体微循环障碍加重可能是影响脑血流量和脑梗死面积改善、限制其修复能力的原因。

      内关穴增加微血管数、减少神经细胞死亡是对三个脑组织的共同作用。在皮层，内关长时间组各指标表现出了优于短、中时间的趋势；在海马部位，内关长时间组坏死神经元数减少,短时间组微血管数显著增加)；在纹状体部位，内关长时间组正常神经元数最多，短时间下微血管数最多。

3 讨论

      本研究探讨针刺时间对经穴效应的影响，实际属于针刺量效关系研究。该研究是针灸行业的基本问题之一，当是一系统研究工程，但总要从一穴、一个针刺参数变量开始。因此，我们选取了醒脑开窍针刺法的主穴之一内关为刺激点，从时间与频率两个可人为量化控制刺激量[5]的方面，模拟临床慢频率（1次/秒，即60次/分）下5秒、60秒、180秒三个针刺刺激时间为干预手段，探讨特定经穴效应的针刺量学影响因素问题。

      在中医理论中，内关为心包经络穴，八脉交会穴之一，通阴维脉。心包经与心经相表里，代心受邪。心主血脉，主司周身的血液供应。醒脑开窍针刺法选择内关为主穴之一，取其养心安神、疏通经络、运行气血之功。现代医学证实，内关穴能特异性的降低心脏的耗氧量、减少脑梗死发生后引发的急性心肌，并增强泵血功能，提高脑的灌注量[6]。本研究结果显示，三种针刺参数下，内关穴的效应均优于非针刺组，即针刺内关穴可提高神经功能评分，增加脑血流和降低梗死率，进一步证实针刺经穴改善疾病症状、减轻病理变化的有效性。同时显示当应用较慢针刺频率时，针刺内关穴有效性的强弱与针刺持续时间相关，表现为随针刺时间的积累可获得更好的治疗效应。对脑组织的HE染色形态学观察提示内关发挥治疗效应的内在机理是改善不同部位微血管数量以改善血液供给[7，8,9]，调整炎性反应，保护正常神经细胞数、降低神经细胞坏死率。这与针刺内关穴能抑制脑组织缺血半暗带Caspase-3的表达，对抗半暗带区细胞的凋亡、促进缺血局部脑组织血管新生有关[10]。生物体作为一个整体，在对来自于外界的刺激可作出一定的反应，而针刺刺激经穴可激发生物体一系列的集联放大作用将机体的正向调节传至全身，产生“小刺激大反应”[11]，而且，本研究由于三种针刺时间干预内关穴均可产生类似效应和机制，从而证明内关穴存在经穴特异性。

      在本研究中，内关短、中、长针刺时间组之间效应不同，如内关中时间组改善改善神经功能缺损评分、减小脑梗死率的特异性比较显著，而长时间组增加脑血流的特异性显著，体现了经穴效应的相对性，即经穴效应可体现在多个方面[12]，针刺时间是影响其发挥某种效应及产生效应大小的因素。同样有其内在机制，短时间组改善海马、纹状体部位微循环作用明显，长时间组抑制海马神经细胞坏死、加强纹状体炎性反应作用明显；中时间组加强海马、纹状体炎性反应作用明显。所以本研究结果可了解针刺时间对经穴效应的影响及其内在机制，但是换一角度，可以推论“获得某种疗效、改善某种机制可以用某种针刺时间”，也就是经穴效应的特异性与针刺刺激的参数相关，为了获得不同的治疗效应可以通过调节刺激参数来实现[13，14]。

      内关穴可以改善MCAO 大鼠神经功能，增加脑血流量减轻脑梗死面积，产生特异性效应，调节其梗死后局部脑组织微循环状态，减低神经细胞坏死率，调整缺血后炎症反应是内关穴特异性效应的内在作用机制；而且，针刺参数是影响经穴特异性的重要因素之一，在频率较低时，延长针刺时间可以获得较好的效应。

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