付伊萌，陈　茜１，吴　帆１，付梦婷１

（１湖北中医药大学/针灸治未病湖北省协同创新中心，武汉 430061）

摘要：目的：观察电针预处理对慢性心肌缺血大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的影响，探讨电针预处理防治慢性心肌缺血的作用机制。方法：采用SPF级雄性wistar大鼠45只，随机分为3组：正常组、模型组、电针预处理组，每组15只。除正常组连续14天皮下注射0.9%NaCl外(2mg/kd/d)，其他两组均每日给予异丙肾上腺素（Isoprenaline，ISO）（2mg/kg/d）皮下注射，每日一次，连续14天。电针预处理组在当天造模前即给予针刺“内关”、“关元”、“足三里”，该组同侧穴位组成一对，即同侧“内关”穴连接同侧“足三里”穴，连接HAN-200型电针仪，频率2Hz，电压1.6V，强度1mA，以大鼠肢体有震颤感为适宜强度，每次10min，正常组和模型组相同时间抓取固定，每日一次，共21天。应用Agilent Sonos 5500型彩色超声心动图诊断仪检测计算左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）以及左室射血分数（LVEF），以 LVEF≤45%为造模成功；记录治疗后各组大鼠的心电图及ST段电压变化；采用Elisa检测各组大鼠血清中的VEGF含量; Western blotting检测心肌梗死区VEGF表达。结果：模型组大鼠的左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)均高于正常组（P＜0.01），左室射血分数（EF）低于正常组大鼠（P＜0.01）；电针预处理组LVEDD值低于模型组（P＜0.01），LVESD值低于模型组（P＜0.01），EF值高于模型组（P＜0.01）；造模后，模型组大鼠ST段电压明显高于正常组，血清中VEGF含量高于正常组（P<0.01）；造模及治疗后，电针预处理组大鼠的ST段电压低于模型组，电针预处理组VEGF含量高于模型组（P<0.01）。模型组心肌组织梗死区VEGF蛋白表达低于正常组（P<0.01），电针预处理组心肌组织梗死区VEGF蛋白表达高于模型组（P<0.01）。结论：电针“内关”、“足三里”、“关元”预处理，可促进慢性心肌缺血大鼠VEGF表达，促进血管再生，改善心功能、缩小缺血心肌面积，有效防治慢性心肌缺血。

关键词：电针预处理；心肌缺血；VEGF   

Abstract：Objective：To observe the effect of electroacupuncture preconditioning on vascular endothelial growth factor (VEGF) in rats with chronic myocardial ischemia, and to explore the mechanism of electroacupuncture preconditioning in preventing and treating chronic myocardial ischemia.  Methods：The 45 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: control group, model group, EA group, 15 rats in each group.In addition to the normal group for 14 consecutive days under the subcutaneous injection of 0.9%NaCl (2mg/kd/d), the other two groups were given daily ISO (2mg/kg/d) (ISO) subcutaneous injection, once a day, for 14 consecutive days.The EA group began to give acupuncture treatment before the start of that,which  is given needling "Neiguan","Guanyuan" and "Zusanli",connected the same side of "Neiguan" with "Zusanli", connecting the HAN-200 electro acupuncture device, frequency 2Hz, voltage 1.6V, intensity 1mA,which is suitable for the rat limb tremor, 10min each time.Control group and model group grab a fixed at the same time, once daily for 21 days. Detection of left ventricular end diastolic diameter(LVEDD),left ventricular end systolic diameter (LVESD) and left ventricular ejection fraction (LVEF) by Sonos Agilent 5500 color Doppler echocardiography, with LVEF≤45% for successful model.Record the electrocardiogram and ST voltage change of rats after treatment;Elisa was used to detect the content of VEGF in the serum of rats;HE staining was used to observe the pathological changes of myocardial tissue, and the expression of VEGF in myocardial infarction area was detected by Western blotting.　Results:Left ventricular end diastolic diameter(LVEDD) and left ventricular end systolic diameter(LVESD) of model group were higher than control group(P<0.01),left ventricular ejection fraction(EF) of model group were lower than the control group(P<0.01);the LVEDD and LVESD value of the EA group were lower than the model group(P<0.01),the EF value is higher than the model group(P<0.01).After modeling, the voltage of the ST segment in the model group was significantly higher than that of the control group(P<0.01),the difference of VEGF content between model group and control group was statistically significant(P<0.01).After treatment,the ST segment voltage of the EA group was lower than that of the model group(P<0.01).Compared with model group,the content of VEGF in EA group was higher than that of model group(P<0.01).The expression of VEGF protein in the model group was lower than that in the control group(P<0.01),and the expression of VEGF in the myocardial infarction area of the EA group was higher than that of the model group (P<0.01).　Conclusion:　Needling "Neiguan","Zusanli" and "Guanyuan" can promote the expression of VEGF in rats of chronic myocardial ischemia,promote angiogenesis,improve heart function,and reduce myocardial ischemia area,which may contribute to the prevention and treatment of chronic ischemic heart disease.

Key words:　Ectroacupuncture preconditioning, Myocardial ischemia, VEGF

       目前研究证明，血管新生（Angiogenesis，AG）可促使缺血周边组织侧支循环的建立[1、2]，心肌缺血后，缺血区血管新生和侧枝循环的水平能直接影响心脏梗死的面积、心室重构的程度及心功能的改善情况[3]。AG在已有血管的基础上，通过血管内皮细胞的增殖、游走、芽生和血管分裂而形成新的微血管网，从而恢复血运，有效防止缺血心肌坏死和凋亡[4]。研究证实[5、6]，针刺可以通过多种途径来实现心肌保护，比如减少自由基的产生，调控凋亡基因的表达水平等，那么针刺是否能通过促进血管再生从而达到保护心肌细胞，缓解组织缺血、缺氧的作用，值得我们进一步研究与探讨。笔者以慢性心肌缺血大鼠为模型，从血管再生这一角度，观察电针预处理对慢性心肌缺血大鼠血管内皮生长因子的影响，探讨针刺防治心肌缺血的作用机制。

1.材料与方法

1.1实验动物与分组 

       采用3月龄SPF级雄性Wistar大鼠45只（湖北省动物实验研究中心购买，动物许可证号：SCXK(鄂)2008-0005，实验动物质量合格证号：42000600006844），体重250-300g。随机分为3组：正常组、模型组、电针预处理组，各15只，大鼠适应性喂养1周后开始实验。实验过程严格遵循2006年国家科技部发布的《关于善待动物的指导性意见》。

1.2造模

      参照Yin等[7]造模方法，模型组及治疗组均采取腹部皮下注射盐酸异丙肾上腺素2mg/kg，连续14天。14天后用M型彩色超声监测仪测量左室射血分数(LVEF)，以 LVEF≤45%作为造模成功。

1.3干预方法

      造模开始当天即行干预治疗。正常组连续14天腹部皮下注射生理盐水，模型组、电针预处理组行心肌缺血造模，模型组不进行针刺干预，与电针预处理组相同时间抓取固定；电针预处理组采取针刺干预治疗，针刺取穴参照《实验针灸学》的常用实验动物针灸穴位定位方法取穴[8]，选用28号0.5寸（0.38mm×13mm）不锈钢针（华佗牌GB2024-94,苏州医疗用品厂生产）直刺0.2-0.4寸。电针预处理组于造模前给予“内关”（PC6）、“足三里”（ST36）及“关元”（CV14）穴电针治疗，该组同侧穴位组成一对，即同侧“内关”穴连接同侧“足三里”穴，连接HAN-200型电针仪，频率2Hz，电压1.6V，强度1mA，以大鼠肢体有震颤感为适宜强度。每次10min，每日一次，共21天。

1.4取材及标本处理

       各组动物根据实验要求在实验结束后的第二天（第22天），10%水合氯醛溶液按0.35ML/100g剂量麻醉后，腹主动脉取血收集动物血样，开胸取心脏组织样本，每组15个标本，4%多聚甲醛（双蒸水配制）4℃固定24小时,以用于心肌组织病理学结构观察。用剪刀剪取约50mg组织，置于组织匀浆器中，匀浆、离心，置于-80℃冰箱保存用于免疫印迹检测蛋白。 

1.5仪器及主要试剂

      盐酸异丙肾上腺素（ISO）：上海禾丰制药有限公司生产（规格 2ml：1mg，上海禾丰制药有限公司，批号：S1105）；包埋石腊（国药集团，NO:10011018）；中性树胶（国药集团，NO：10004160）；HAN-200型电针仪（南京济生医疗科技有限公司）；迷你电泳槽（北京六一Cat#DYZC-24DN）；病理切片机（德国Leica RM 2016轮转式切片机）；切片刀（日本羽毛R35一次性刀片）；组织摊烤片机（武汉俊杰JK-6生物组织摊烤片机）；显微镜（OLYMPUS BX53型生物显微镜）；Agilent Sonos 5500 型彩色二维超声心动图诊断仪（美国Philips公司）；-80℃低温冰箱（日本SANYO公司）。

1.6指标检测

1.6.1超声心电图

       大鼠在第22天，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以备皮刀心前区剃毛，仰卧固定于鼠板上，应用Agilent Sonos 5500型彩色超声心动图诊断仪，10S探头，频率为8MHz，对大鼠的心脏大小及功能进行检测。检测指标包括：左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD），并通过计算机计算出左室射血分数（LVEF）。

1.6.2心电图

        记录造模前各组正常时心电图，治疗结束后第2天，即第22天再次使用BL-420生物机能系统检测各组大鼠的心电图。大鼠用10%水合氯醛麻醉后， 仰卧位固定于恒温控制操作台上 用针状电极刺入大鼠肢体皮下，按人体标准导联（Ⅱ） 连接方法：将正极接在左下肢，负极接在右上肢通过 BL420生物机能测试系统记录心电图，观察ST段电压的变化。

1.6.3酶联免疫吸附试验（Elisa）检测血管内皮生长因子（VEGF）

       于第22天取材时，麻醉开胸暴露心脏，采用心脏部位取血法收集大鼠血液于抗凝管中，置于4℃冰箱保存24h，将血液样品1000r／min，离心15min后吸取上清，待测。

1.6.4蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测血管内皮生长因子（VEGF）

       用剪刀剪取约50mg组织，置于组织匀浆器中，匀浆、离心，洗膜后加入二抗，室温振荡孵育，充分洗膜并进行显色。VEGF蛋白的含量水平用VEGF蛋白灰度值来表示(该蛋白条带的灰度值=背景的灰度值)/(内参条带的灰度值=背景的灰度值)，以此比值计算均数与标准差。

1.7数据分析

       数据采用SPSS20.0处理分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著性统计学意义。

2.结果

2.1各组大鼠的心脏功能的比较（见表1、图1）

       模型组大鼠的左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)均高于正常组（P＜0.01），左室射血分数（EF）低于正常组大鼠（P＜0.01）且EF≤45%，提示造模成功。电针组LVEDD值均低于模型组（P＜0.01），LVESD值低于模型组（P＜0.01），EF值高于模型组，具有非常显著性差异（P＜0.01）。

2.2各组大鼠治疗后的ST段电压比较

        造模及治疗前，正常组、模型组及针刺组比较ST段电压无统计学差异；造模后，模型组大鼠ST段电压明显高于正常组（P<0.01），且明显高于造模前模型组（P<0.01）；造模及治疗后，电针预处理组大鼠的ST段电压低于模型组，具有非常显著性差异（P<0.01）。

注：与正常组比较，#P<0.01;与模型组比较，*P<0.01。 

2.3各组大鼠血清中VEGF含量比较（见表2）

       模型组血清中VEGF含量高于正常组，具有非常显著性差异（P<0.01）;与模型组比较，电针预处理组血清中VEGF含量上升，具有非常统计学差异（P<0.01）。

2.4各组大鼠心肌梗死区VEGF蛋白表达

        图4、5可见，心肌梗死区模型组大鼠VEGF蛋白的表达明显低于正常组（P<0.01），电针预处理组心肌梗死区VEGF蛋白表达高于模型组（P<0.01）。

3讨论

       新生血管属中医之“血络”范畴，《灵枢·血络论》云：“血络者，外之络脉、孙脉，见于皮肤之间，血气有所留积，则失其外内出入之机。”《内经》中“血络”一般指细小的血管，或是经络系统中的络脉、孙络。《灵枢·热病》云：“心病暴痛，取足太阴、厥阴，尽刺去其血络。”因此，就中医而言，心气的盛衰与血络的功能活动息息相关，心脏发生病变，常影响血络的功能，反之，血脉之病变，也应从心而治[9]。“心肌缺血”属中医学的血络损伤气血不足、血运不通、不荣之证。一般认为“心肌缺血”的病机属“本虚标实”，“本虚”虚者多为气、血、阴、阳亏虚，尤以气虚及阳虚多见；“标实”者多为气滞、血瘀、痰浊等，又以血瘀及痰浊多见。临床上，针灸治疗心肌缺血一般应用循经取穴法、辨证取穴法、分部取穴法等选穴方法，但因个体差异性和针刺手法及技术的差异性，临床效果也有差异。本实验在中医“治未病”思想的指导下，应用“标本配穴”法[10]选取“内关”用于祛除病邪，“内关”所属心包经，为手厥阴心包经络穴，通于任脉，会于阴维，是八脉交会穴之一，一直为古今针灸防治心绞痛、心肌炎等心胸疾病的经典穴和首选穴；再选取“关元”、“足三里”两穴位用以固护先天、后天之气，达到标本兼治，通补兼施[11]。因此，笔者以选取针刺“关元”、“足三里”、“内关”穴作为电针预处理组，用以防治慢性心肌缺血，探讨电针预处理防治心肌缺血疾病的疗效。

       VEGF是一种肝素结合蛋白，组织缺血缺氧可反馈性的刺激VEGF表达增加[12]，并且可促进内皮细胞有丝分裂和新生血管的形成，作为AG正性调控因子中己知作用最强、特异性最高血管生成因子，可通过增加血管通透性，抑制细胞凋亡，促进内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)增殖、迁移，从而促使新生血管的形成，缓解心肌缺血缺氧[13]。当发生心肌缺血时，心肌缺血大鼠心肌组织和血清受到刺激促进VEGF表达，血管新生形成并开放冠脉侧支循环[14]，能减轻损伤心肌的缺血缺氧、防止心肌细胞坏死、预防和延缓的形成，缺血区血管再生和侧支循环的水平影响心脏梗死的面积，同时也影响心室重构的程度及心功能的改善情况。已有实验证明[15]，内关穴位埋针可通过上调VEGF基因及蛋白表达，增加毛细血管密度，促进侧支循环建立，增加缺血心肌血流，使缺血心肌损伤修复。

      本实验发现，心肌缺血后，心功能出现异常，ST段电压上升，反馈性刺激多种细胞分泌VEGF导致血清中VEGF表达上升，促进血管生成因子合成和血管内皮修复，缓解组织缺血缺氧，心肌梗死区VEGF表达下降。电针预处理干预后，电针预处理组较模型组ST段电压下降，血清中和心肌梗死区的VEGF表达增加，较模型组明显改善，说明电针预处理可明显改善心脏功能，刺激心肌梗死区和血清中VEGF表达增加，促进血管再生，缩小缺血心肌面积，降低缺血对心肌的损伤，保护心肌组织。

      目前，“穴位针刺预处理”已广泛应用于防治各类疾病，例如心、脑、胃肠等预防和抗缺血缺氧时采用。“穴位针刺预处理”这种理念的运用正是针灸“治未病”思想在现代医学模式下的产物，与现代医学预防疾病思想有异曲同工之妙[16]。本实验在此理念的指导下，采取14天的电针预处理和7天的造模后穴位电针治疗相结合的实验方法，并依据“标本配穴”法进行选穴，目的在于通过鼓舞机体正气，加强机体的抗病能力，从而预防心肌缺血的发生和（或）减轻心肌缺血对机体的损害，恰与中医“治未病”中的“未病先防，既病防变”吻合。实验证实，针灸“治未病”对于防治慢性心肌缺血具有一定功效，这为以后的临床运用提供了实验依据。

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