孔　莹¹，邹　伟²

（1 黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001；2 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040）

摘要：研究目的：通过观察“百会透曲鬓”针刺法对脑出血急性期大鼠模型脑组织中白介素-6（IL-6）蛋白表达的影响，研究本针刺法对脑出血后继发性脑损伤的神经保护机制，从而指导临床实践。研究方法：1、选用雄性Wistar大鼠60只随机分为四组：空白组6只、模型组、针刺组、西药组（脑复康）各18只。2、建立大鼠脑出血模型。 3、针刺腧穴选择：百会穴透曲鬓穴，在头部贯穿顶额颞三区，一针贯穿多穴。4、造模且完成相应治疗后于6h，2d，7d三个时间点进行神经功能学评分，然后处死大鼠，取大鼠脑组织做指标检测。5、用免疫组化分析法（IHC）检测脑组织中IL-6蛋白表达的平均灰度值，在光镜下观察脑组织形态学变化。6、进行统计学处理。研究结果：1、针刺治疗和西药治疗均能减少神经功能缺损评分。造模后2d针刺组与模型组比较有显著性差异(P<0.01)，针刺组与脑复康组比较有明显差异(P<0.05)。 造模后7d脑复康组与模型组比较，有明显差异 (P＜0.05)。针刺组与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。2、大鼠脑组织中IL-6IHC检测的平均灰度值，空白组与模型组比较均有意义。造模后2d，针刺组与模型组比较有显著性差异(P<0.01)，针刺组和脑复康组两者结果有差异（P<0.05）。造模后7d时，脑复康组与模型组比较，IL-6阳性细胞平均灰度值减少(P<0.05)，针刺组与模型组相比，IL-6阳性细胞平均灰度值明显减少(P<0.01) 针刺组和脑复康组两者结果有差异（P<0.05）。3、光镜下脑组织病理改变结果针刺组和西药组与模型组有差异。结论：1、本针刺法可明显改善大鼠的神经功能学评分，有利于脑出血后肢体运动功能的恢复。2、研究显示在脑出血急性期，针刺“百会透曲鬓”穴可以通过下调IL-6的蛋白表达，减轻脑出血后炎性反应导致的继发性脑损伤程度，从而改善脑组织缺血缺氧状态及保护受损伤的神经元细胞。

关键词：脑出血大鼠模型；“百会透曲鬓”针刺法；白介素-6

The Experimental Influences of Baihui-Qubin Acupuncture on Interleukin-6 Expression of Rats with Intracerebral Hemorrhage

KONG Ying¹, ZHOU Wei²

（1 The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang Harbin 150001；2 The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang Harbin 150040）

Abstract: Objective: By observing the BaiHui-QuBin scalp-acupuncture on acute cerebral hemorrhage in the rat model of brain tissue IL-6 protein expression, to study the acupuncture on the cerebral hemorrhage secondary brain injury after the neuro protective mechanisms in order to guide clinical practice. Methods: 1.Totally 60 male wistar rats were randomly allocated into four group:blank group(n=6),intracerebral hemorrhage control group(n=18),acupuncture group(n=18),and western medicine (pisacetam) group(n=18). 2.The rat models of acute intracerebral hemorrhage were made.3.The acupuncture point: BaiHui point to QuBin point, which can penetrate three regions of the cupula and forehead and temple.4.The Berderson neural deficit scores were tested at three time points(6h,2d,7d after hemorrhage model establishment)before the r-at models were killed, then the brains were removed and index were detected. 5.The average gray scale of Interleukin-6 protein expressio-n by immunohistoc-hemical method were checked,the morphologic cha-nge on light microscope was observed. 6. Statistical treatment was made. Results: 1.The results of the neurologic deficit score of the acupunct-ure group is better than intracerebral hemorrhage group and western medicine group at 2 days. Acupuncture group and western medicine group were better than those in intracerebral hemorrhage group at 7 days. 2.The results of masculine cell in the average gray scale of Interleukin-6 in untreated control group is different from intracerebra-l hemorrhage gro-up (ICH).In 2 days,the average gray scale of Interleukin-6 in acupu-ncture group is lower than those in intracerebral hemorrhage group.T-here was also difference between acupuncture group and western medi-cine group. Acupuncture group and western medicine group were low-er than those in intracerebral hemorrhage group,and there was differe-nce between acupuncture group and western medicine group in 7 days.3.The results of the brain pathological change in acup-uncture group and western medicine group is different from those in intracerebral hemorrhage group. Conclusion:1.BaiHui-QuBin acupuncture can obviously raise the B-erderson neural deficit scores, and have the benefit of improvement of extremity function after intracerebral hemorrhage.2. Study showed that acute phase of cerebral hemorrhage, BaiHui-QuBin scalp-acupuncture therapy can be reduced IL-6 protein expression, reduce the inflammatory response after cerebral hemorrhage caused by the extent of secondary brain injury, ischemic brain tissue in order to improve status and the protection of hypoxic injury in neurons.

Key words: Acute intracerebral hemorrhage, Acupuncture, BaiHui-QuBin, Interleukin-6

       脑出血（Intracerebral hemorrhage， ICH）起病急骤、病情凶险、死亡率高，为目前中老年人致死性疾病之一。以40-70岁为主要的发病年龄。一般认为脑出血的发病原因与高血压、动脉瘤、动静脉畸形、凝血功能障碍、脑淀粉样血管病、头部外伤、颅内肿瘤以及抗凝药物的应用等因素有关。本实验课题通过观察“百会透曲鬓”针刺法治疗脑出血急性期模型大鼠的IL-6在脑组织中阳性表达的情况、脑出血后病理的改变情况以及大鼠神经功能缺损情况，从而探讨了“百会透曲鬓”针刺法在治疗急性期脑出血后继发性损伤的神经保护机理及与大鼠脑组织中IL-6免疫组化表达的相关性，以便有效地指导临床治疗。

1实验材料与方法

1.1 材料

      健康清洁级雄性Wistar大鼠，体重（350±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物质量合格证书号：SCXK（京）2007-0001，实验前正常饲养1周。造模前禁食12h，禁水6h。

1.2方法

1.2.1实验动物分组

      按体重将60只健康雄性大鼠随机分为正常组，模型组，模型+针刺组（简称针刺组），模型+脑复康组（简称脑复康组）四组。正常组6只大鼠，模型组、针刺组、脑复康组各18只大鼠。

1.2.2脑出血模型的制备

       根据大鼠脑立体定位图谱[1]确定右侧尾壳核位置。参照邹氏法[2]和Rosenberg方法[3]等报道的方法制作脑出血大鼠模型。将大鼠用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，使上门齿钩平面比耳间线平面低2.4mm，这样大鼠前囟和后囟在同一水平面上。取头皮正中，备皮消毒，正中切口，长度约1cm，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取前内点(Bregma)右旁开3.5mm，后0.2mm定点，用牙科钻钻直径为1.0mm的圆孔，深达硬脑膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3cm处剪断鼠尾，用微量注射器取血50μl，将微量注射器固定于立体定位仪上，沿钻孔垂直进针约6mm，将未肝素化的血液50ul以25ul/min速度推进尾壳核，留针约5min，缓慢出针。留针期间酒精棉球包扎鼠尾断端伤口。术后局部喷洒庆大霉素，用口腔科磷酸锌水门汀封闭颅骨创口，缝合头皮，局部皮肤采用碘酚消毒，防止局部感染影响指标观察。

1.2.3行为学观察

       各组大鼠造模成功后，待大鼠清醒后，即于术后6h、2d、7d评价神经功能缺损体征，根据Berderson神经体征评分法[4]：轻提大鼠尾巴悬吊高于桌面20cm处，观察前肢情况。正常大鼠双前肢向地面伸直。0分：无神经功能缺损；1分：脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲；2分：上述体征+向麻痹侧推阻力下降；3分：活动时向麻痹侧打圈（呈追尾状）。而测推阻力时，须将大鼠置于软皮革包被的桌面上，防止因大鼠不能抓牢桌面，不能形成足够的摩擦力而导致结果的误判。

1.2.4各组实验动物处理方法

       正常组：6只大鼠，不做任何手术处理，直接断头取材。

       模型组：18只大鼠，按时相分为6h、2d、7d三个时相点，每个时相点6只大鼠，于脑出血造模后6h、3d、7d分别取材。

       针刺组：18只大鼠，按时相分为6h、2d、7d三个时相点，每个时相点6只大鼠，于脑出血造模后6h、2d、7d分别给予针刺治疗，各给予针刺1次。针刺患侧百会穴透曲鬓穴，取穴方法参照华兴邦等[5]制定的《实验动物穴位图谱》留针30分钟，期间捻转3次，每次5分钟，以200转/min速度捻针。针刺治疗后于脑出血造模后6h、2d、7d分别取材。

脑复康组：18只大鼠，按时相分为6h、2d、7d三个时相点，每个时相点6只大鼠。于脑出血造模后6h、2d、7d分别给予脑复康稀释液灌胃（按人：大鼠体重为200：1配置）6h组1ml灌胃。2d组连续灌胃2d，1ml/次、3次/d。7d组连续灌胃7d，1ml/次、3次/d。脑复康稀释液灌胃治疗后于脑出血造模后6h、2d、7d分别取材。

1.2.5标本取材

       术后在相应时相点过量麻醉，迅速开胸暴露心脏，从左心室插管至升主动脉根部，在右心耳剪开一小口做出口。4℃生理盐水200ml快速灌注，之后稍减慢灌注速度冲洗至流出液清亮，换4%多聚甲醛200ml快速灌注，之后稍减慢灌注速度继续固定灌注约30分钟至动物四肢僵硬。断头取脑，以注射针道为中心做冠状切片，厚度约5mm。部分标本将其放入4%多聚甲醛/0.1MPBS固定液中固定，然后按常规脱水、浸蜡、包埋制成厚度5μm的石蜡切片用于HE染色，IL-6IHC检测。

1.2.6HE染色

      石蜡切片，常规脱蜡水化，苏木精5分钟，水洗，盐酸酒精分化20秒，充分水洗，弱氨水返兰20秒，充分水洗并浸泡10分钟，伊红染色20分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.7图像分析

      显微镜下，DAB显色阳性细胞呈棕黄色或褐色，利用Motic image 3.2图像采集系统采集图像并进行分析，在Motic-BA400倍显微镜视野下观察。

1.2.8统计学处理

      采用Microsoft office excel软件进行统计。计量数据以均数±标准差(±s) 表示。各实验组间的两两比较采用t检验，以P＜0.05为有差异，以P＜0.01为显著差异，均有统计学意义。

结  果

1. 神经功能学评分

       各组大鼠术后平均30min苏醒，空白对照组的大鼠表现正常，各造模组出现不同程度的病灶对侧偏瘫，爬行时向右划圈，瘫痪侧前肢回收屈曲腹下，瘫痪后肢向后外展。各造模组大鼠均无自行死亡。以2d时神经功能缺损最为严重，多数大鼠有追尾现象或不能站立。术后6小时，变化不明显，无统计学意义。术后2d，针刺组大鼠神经功能缺损征恢复明显，与模型组比较，有显著差异(P＜0.01)，与脑复康组比较有明显差异(P<0.05)。术后7d，脑复康组与模型组比较有明显差异(P<0.05)，针刺组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。详见表2。

2.光镜下脑组织的病理改变

        正常组大鼠脑组织结构整齐，细胞形态正常，无出血灶，无炎性细胞浸润。

模型组大鼠术后6h，镜下可见明显出血灶。2d组的脑组织水肿和细胞间隙空化明显，血肿周围可见神经细胞固缩，核浓染，毛细血管扩张、充血，管壁肿胀，周围可见炎性细胞浸润，以淋巴细胞、中性粒细胞为主。7d时坏死区缩小，小血管增生显著，水肿带不明显，神经细胞固缩不明显。

        针刺组大鼠术后6h可见坏死区大量白细胞渗出，少量炎细胞浸润，边缘水肿带明显。术后2d可见出血灶周围脑组织修复，水肿程度较模型组减轻，炎性细胞数量减少。针刺治疗7d后坏死区基本消失，少量炎细胞浸润，出现较多新生的毛细血管，水肿带已不清楚。与模型组比较，针刺组坏死灶范围较小，炎细胞粘附和浸润现象明显减轻，由此提示头穴针刺可促进侧支循环的建立，减少坏死灶面积，对脑出血损伤脑组织具有明显的神经功能保护作用。

3.IHC检测IL-6蛋白表达

       空白对照组大鼠脑组织神经细胞结构较整齐，细胞形态正常，未见IL-6阳性细胞棕黄色表达，故未计入统计范围内，只对模型组，脑复康组，针刺组三组比较。

       IHC检测IL-6蛋白表达:血肿周围脑组织中IL-6阳性细胞表现为:胞浆内呈现棕黄色的广泛分布的小颗粒,细胞核也有部分着色。血肿形成后,模型组及针刺组大鼠血肿周围脑组织阳性细胞平均灰度值均随不同时相点的变化而逐渐增加，2天时达高峰，7天时有所下降。空白组与模型组IL-6平均灰度值比较均有意义。术后6h各组无明显差别(P＞0.05)。术后2d，针刺组与模型组相比，IL-6平均灰度值明显下降，有显著差异(P＜0.01)，且两治疗组之间相比，针刺组比脑复康下降更明显(P＜0.05)。术后7d，脑复康组与模型组比较，IL-6平均灰度值下降(P＜0.05)，针刺组与模型组相比，IL-6平均灰度值明显下降(P＜0.01)，两治疗组之间相比，针刺组比脑复康下降更明显(P＜0.05)。详见表1。

讨论

实验指标评价

       IL-6在脑内主要由神经胶质细胞分泌，神经元、血管内皮细胞等也产生IL-6，并在脑损伤中发挥调控炎症反应的重要作用。脑出血后IL-6 在脑组织及血浆中水平升高是白细胞及神经组织受损的免疫应答改变。它是人血浆中能测出的少数细胞因子之一[6]。研究发现其血浆含量的改变与脑组织含量的改变，有良好的相关性，与出血量大小呈相关。因此,监测IL-6在脑出血后血浆中的变化对了解脑继发性损伤及判别预后有积极的意义。

       在本动物实验中，采取IHC检测急性脑出血大鼠模型脑组织中IL-6的阳性表达，通过对比不同时间点IL-6阳性表达的不同，来反映脑出血的脑损伤机制及采取针刺或药物治疗后脑损伤程度的减轻。

本实验显示出从脑出血开始，在6h时间点即有IL-6的阳性表达，这反映出了脑出血损伤机制中有血肿的直接压迫周围脑组织而导致的损伤。而在2d时间点IL-6的强烈表达，又与脑出血后脑水肿的高峰期的出现一致。故IL-6的免疫组化的表达不仅可以研究和证实脑出血的发病机制，而且对本实验中针刺和西药对脑出血急性期的治疗的研究起到了客观评价的作用。

参考文献

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[2] 邹伟.针剌对脑出血急性期大鼠血浆内皮素含量的影响[J].中国中医药科技.1998(5):302

[3] Rosenberg GA,Mun-Bryce S,Wesley M,etal.Collagenase-induced intracerebr-alhemorrhage in rats

[J].Stroke,1990,21(5):801-807

[4] Berderson JB,Pitts LH,Tsuji M, etal.Stroke 1986,17:472-476

[5] 华兴邦,李辞蓉,周浩良,等.大鼠穴位图谱的研制[J].实验动物与动物实验.1991,(1):1-5

[6] Kim J S,Yoon SS,Kim YH,Ryu J S.Serial measurement of inter2lukin26,Transforming growth factor2beta and S2100 protein in pa2tients with acute stroke [J].Stroke,1996,27(9):1553–1557