贲定严，刘 琼1，易 展1，李 丹1，邹逸凡1，马明珠1，刘 密1，常小荣1

（湖南中医药大学，长沙市含浦科教园区，长沙 410208 中国）

摘要：目的：通过观察隔药饼灸对脾虚证大鼠胃组织分裂原活化蛋白激酶(MEK1/2)及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白表达的影响，探讨隔药饼灸治疗脾虚证的可能作用机制。方法：将60只SPF级Sprague-Dawley (SD)大鼠按随机数字表法分为空白对照组（A组）、模型组（B组）、雷尼替丁组（C组）和隔药饼灸组(D组)，每组15只。通过200%的大黄浓缩液4 ℃灌胃制作脾虚证大鼠模型。造模成功后，C组按25 mg/(kg·bw)灌胃给药，D组接受隔药饼灸足三里和中脘治疗，连续治疗8 d。除A组外，其余组大鼠于治疗完成的第二天上午8:00接受消炎痛5mg/(kg·bw)灌胃，7 h后处死动物，取胃。应用苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察大鼠胃组织病理学改变，采用免疫组化法检测大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达。结果：干预结束后，与A组相比，B组大鼠胃黏膜损伤明显，可见较大的破损、脱落；与B组比较，C组大鼠胃黏膜表面有部分脱落，破损情况改善，D组大鼠胃黏膜表面较完整，脱落及破损明显改善。干预结束后，与A组比较，其他各组大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达明显升高(均P＜0.01)；与B组比较，C组和D组大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达升高（均P＜0.01）；与C组比较，D组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达升高（P＜0.01）。结论：隔药饼灸通过提高胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达，激活MEK/ERK信号转导通路，进而促进脾虚证大鼠胃黏膜的修复。

关键词：针灸学；灸法；间接灸；足三里；中脘；穴位研究 

Effect of herbal cake-partitioned moxibustion on MEK1/2 and ERK1/2 expressions of gastric tissues in rats with spleen deficiency syndrome

BI Dingyan¹，LIU Qiong¹，YIZhan¹，LI Dan¹，ZOU Yifan¹，MA Mingzhu¹，LIU Mi¹，CHANG Xiaorong¹（Hunan University of Chinese Medicine, Science and Education Park at Hanpu in Changsha City, Changsha 410208  China）

Abstract: Objective: To observe the effect of herbal cake-partitioned moxibustion on the expression of mitogen-activated protein kinase (MEK1/2) and extracellular regulatory protein kinase (ERK1/2) in gastric tissues of rats with spleen deficiency syndrome, and to explore the possible mechanisms of herbal cake-partitioned moxibustion on the spleen deficiency syndrome. Methods: Sixty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into a blank control group (group A), a model group (group B), a ranitidine group (group C), a herbal cake-partitioned moxibustion group (group D), 15 rats in each group. Rat models of spleen deficiency syndrome were made by intragastric administration of 4 ℃ and 200% concentrated Da Huang (Radix et Rhizoma Rhei). After successful modeling, the rats in group C were treated with 25 mg/(kg·bw) ranitidine by intragastric adminstration and group D were treated with herbal cake-partitioned moxibustion at Zusanli (ST 36) and Zhongwan (CV 12), for 8 d. Excepted for rats in group A, all the other rats were treated with 5 mg/(kg·bw) of indomethacin at 8:00 a.m. on the second day after finishing all the intervention and sacrificed after 7 h to isolate the stomach. Histopathological changes of the rat gastric tissues were observed under light microscope after hematoxylin-eosin (HE) staining. The protein expressions of MEK1/2 and ERK1/2 in the rat gastric tissues were detected by immunohistochemistry. Results: After intervention, the gastric mucosal injury in group B was significantly severer than that in group A, with large breakage and ablating; the damage of gastric mucosa was decreased in group C compared with group B; the rat gastric mucosal surface remained relative complete, and the status of breakage and ablating was significantly improved. After intervention, compared with group A, the protein expressions of MEK1/2 and ERK1/2 in gastric tissues of other groups were significantly higher (P<0.01). Compared with group B, the protein expressions of MEK1/2 and ERK1/2 in group C and D were significantly higher (all P<0.01). Compared with group C, the protein expressions of MEK1/2 and ERK1/2 in group D were significantly higher (P<0.01).Conclusion: Herbal cake-partitioned moxibustion promotes the repair of gastric mucosa in rats with spleen deficiency syndrome, via improving protein expressions of MEK1/2 and ERK1/2 in gastric tissues, as well as activating MEK/ERK signaling pathway.

Keywords: Science of Acupuncture and Moxibustion, Moxibustion Therapy, Indirect Moxibustion,  Zusanli (ST 36), Zhongwan (CV 12), Research on Acupoints

       脾虚证是指脾气虚弱导致脾失运化的中医病证，是消化性溃疡、慢性胃炎等消化系统疾病的常见中医证型。有研究发现，脾虚大鼠胃黏膜胃底部黏膜缺损，炎细胞浸润，血管扩张充血，黏膜下层水肿[1]。因而有人认为脾虚是以消化系统形态和功能异常为特征的多系统、多功能异常的综合，胃肠黏膜的病变与其相应的功能障碍可能是脾虚证的病理基础之一。有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号传导通路作用于核内转录因子，与细胞增殖和凋亡关系密切，并参与了胃黏膜炎症及损伤过程，其中MEK/ERK 是 MAPK 信号传导通路中的关键环节[2-3]。大量临床研究证实针灸治疗脾胃虚寒证胃炎疗效确切，尤其是艾灸疗法的作用更加明显[4]，导师课题组前期研究证实了艾灸保护及修复胃黏膜损伤疗效确切并阐释了部分作用机制[5-6]。目前，基于MEK/ERK信号转导通路探讨隔药饼灸对脾虚证大鼠胃黏膜细胞增殖的调节机制的研究文献鲜有报道，本实验在前期研究的基础上，通过观察脾虚证大鼠MEK/ERK信号转导通路中重要信号分子MEK1/2、ERK1/2的变化，探讨隔药饼灸对MEK/ERK信号转导通路的影响，为隔药饼灸治疗脾虚证提供部分实验依据，以期阐明隔药饼灸治疗脾虚病证的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

       SPF级Sprague-Dawley (SD)大鼠60只，体重200-250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证：SCXK（湘）2015-0003]，60只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组(A组)、模型组(B组)、雷尼替丁组（C组）和隔药饼灸组（D组），每组15只，实验中对动物的处置均遵守科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2药物、试剂及仪器

      消炎痛片(规格：25 mg/片，批号：151108，山西云鹏制药有限公司，中国）；雷尼替丁胶囊（规格：0.15 g/粒，批号：A151201，天津太平洋制药有限公司，中国）；艾柱（型号：东方一型，苏州东方艾绒厂，中国）；药饼（人参、白术、茯苓、甘草按2:2:2:1比例配伍，碎成粉末备用，用时用醋调匀，药物购自湖南中医药大学第一附属医院）；ERK1/2试剂盒(Proteintech Group, inc.公司, 美国)；MEK1/2试剂盒（Abcam公司，英国)；石蜡、中性树胶（Sigma公司，美国)；苏木素、PBS缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、二步法试剂盒（Wellbio有限公司，美国)；DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)；常规化学试剂(上海国药生物医药有限公司, 中国)。摇床（其林贝尔仪器制造有限公司，中国）、恒温箱（北京市六一仪器厂，中国）、微波炉（美的集团，中国）、切片刀（莱卡，德国）、切片机（浙江金华市益迪医疗设备有限公司，中国）、包埋机（常州市中威电子仪器有限公司，中国）、普通冰箱（合肥荣事达三洋电器股份有限公司，中国）、精密PH计（雷磁-上海仪电科学仪器股份有限公司，中国）、显微镜（Motic麦克奥迪实业集团有限公司，中国）、盖玻片、载玻片（海门市远泰实验器材厂，中国）。

1.3 造模及模型评价

      参考彭艳等人的造模方法[7]：除A组外，其余4组以200%的大黄浓缩液4 ℃灌胃，按10 mL/(kg·bw)灌胃，每天2次，连续14 d。观察大鼠体重、饮食饮水量、毛色、大便、精神状态及行为变化。

脾虚证动物模型评价标准。主症：泄泻，严重时脱肛；食少纳呆。兼症：消瘦，体重减轻；神态萎靡，四肢不收，毛色枯槁；蜷缩聚堆；易疲劳。具备2项主症和2项兼症时，可认为脾虚证模型造模成功。

1.4穴位

     穴位定位参考《实验针灸学》[8]中常用动物穴位定位法及拟人对照法，以胸锁联合和耻骨联合连线下1/4与上3/4交点为肚脐。

     足三里：膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处。

     中脘：脐与胸骨剑突连线中点，约脐上20 mm处。

1.5 治疗及取材

A组: 大鼠不造模，每天捆绑30 min，不做艾灸治疗，连续8 d。

B组: 大鼠造模成功后每天捆绑30 min，不做艾灸治疗，连续8 d。

C组：大鼠造模的成功后按25 mg/(kg·bw)进行雷尼替丁灌胃，1日1次，连续8 d。

D组：剪除大鼠双侧足三里和中脘穴区2 cm×2 cm鼠毛，暴露局部皮肤组织，酒精棉球消毒。用自制大鼠固定夹将大鼠仰卧位固定，待大鼠安静不挣扎后进行隔药饼灸治疗。将艾柱放在药饼[2 mm厚，直径(1.0±0.2) cm]上并固定于穴位上，点燃施灸，待艾柱燃尽后换一壮，足三里和中脘同时施灸，每穴连续灸30 min，连续治疗8 d。

除A组外，其他3组于治疗结束后第二天上午8:00给予消炎痛5 mg/(kg·bw)灌胃，7 h后处死动物，剖腹，将胃的幽门部和贲门部用止血钳结扎，在两结扎线的两端切断食道及十二指肠，摘下全胃。沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗胃内残留物。在超净工作台下，于胃黏膜损伤明显处，取1 cm×0.5 cm大小的组织块，生理盐水冲洗干净，放入4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h，切片，厚度5 µm，用做免疫组化检查。

1.6 指标检测

采用免疫组化法进行ERK1/2、MEK1/2蛋白的检测。

60 ℃烤片45 min。石蜡切片脱蜡至水(先将切片置于二甲苯中10 min，2次，然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇中放置5 min，再用蒸馏水浸洗5 min)。热修复抗原[将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0),电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 min后，反复2次，冷却后0.01 mol/LPBS（pH 7.2-7.6）洗涤3 min × 3次]。加入3%H2O2，室温10 min,以灭活内源性酶，PBS冲洗3 min × 3次。孵育一抗[滴加适当稀释的一抗(MEK1/2比例为1:300, ERK1/2比例为1:100)， 4 ℃过夜，PBS冲洗5 min × 3次。孵育二抗(滴加50-100 μL兔抗鼠IgG抗体-HRP多聚体，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min × 3次)。DAB显色(滴加预制好的显色剂DAB工作液50-100 μL，室温孵育1-5 min，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤)。苏木素复染5-10 min，1%盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗，PBS返蓝。各级酒精（60%-100%）脱水，每级5 min。置二甲苯中10 min，2次。中性树胶封片，显微镜观察，采用Image-Pro-Plus图像分析软件分析。

1.7 统计学处理

用SPSS 21.0 统计软件进行数据处理与分析。计量数据符合正态性时以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 方差齐者用最小显著差异法（least significant difference, LSD）和q检验(Student-Newman-Keuls, SNK)， 方差不齐者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法；不符合正态分布时采用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠一般情况观察

A组大鼠体质量和食量保持在稳定水平，动作敏捷好动，精神状态良好，大便干燥成型，毛色光泽。造模后大鼠体质量增长缓慢，食量下降，活动减少，喜蜷卧，大便溏泄，毛色不泽。干预结束后，C组及D组大鼠食欲增强，活动增加，精神状况明显改善，粪质好转，毛发改善。

2.2 各组大鼠光镜下胃黏膜组织形态学改变

光镜下，A组大鼠胃黏膜表面细胞完整，各层组织结构正常未见萎缩、脱落或缺损。B组大鼠胃黏膜损伤明显，可见较大的破损脱落。与B组比较，C组大鼠胃黏膜表面有部分脱落，破损情况改善。与B组比较，D组大鼠胃黏膜表面较完整，脱落及破损明显改善（图1）。

图1. 各组大鼠光镜下胃黏膜组织形态学观察 (HE，×100)

2.3胃组织MEK1/2蛋白表达

干预结束后，与A组比较，其他各组大鼠胃组织MEK1/2蛋白表达明显升高（P＜0.01）;与B组比较，C组和D组胃组织MEK1/2蛋白表达升高(P＜0.01)；与C组比较，D组胃组织MEK1/2蛋白表达升高  (P＜0.01), (表1和图2）。

2.4胃组织ERK1/2蛋白表达

       干预结束后，与A组比较，其他各组胃组织ERK1/2蛋白表达明显升高（P＜0.01）。与B组比较，C组和D组胃组织ERK1/2蛋白表达升高（P＜0.01）；与C组比较，D组胃组织ERK1/2蛋白表达升高(P＜0.01), (表2，图3)。

3 讨论

       脾胃虚是消化系统疾病特别是胃黏膜局部损伤发生、发展与转归的关键因素，脾虚可影响胃黏膜屏障功能，破坏胃黏膜防御机制，导致慢性胃病的发生[9]。因此，改善脾胃亏虚状态可以提高胃黏膜自身的保护及防御功能。

      灸法是最具传统特色的中医外治法之一，其温热刺激能产生良好的温通及温补效应，从而发挥养生保健和防病治病的功效[10]。隔药饼灸可通过穴位刺激、温热刺激及药物作用等多个途径起到保护胃黏膜的作用。本研究选用的足三里能健脾益胃、理气化湿；中脘可健脾和胃，通调六腑，二者是治疗脾胃虚弱病证的常用组合。药饼成分为四君子汤，是健脾的经典方剂。现代药理研究发现四君子汤可减少损伤的胃黏膜细胞的凋亡,减少胃黏膜疾病的发生[11]。三者协同发挥，效果相得益彰。实验已证实隔药饼灸对应激大鼠胃黏膜损伤有保护作用,其机制可能与增加胃黏膜血流量,调节降钙素基因相关肽和转化生长因子α的水平有关[12]。因此进一步探讨隔药饼灸对脾虚证大鼠胃黏膜的保护作用对于临床辨证分型治疗具有重要意义。

      细胞内的MAPK信号转导通路能将细胞外信号转导至细胞及细胞核内，它参与了细胞凋亡、增殖及炎症性组织损伤，其核心是3种蛋白激酶构成，即Raf/MEK/ERK[13]。Raf是分子质量为 40-75 kD 的丝氨酸/苏氨酸(serine/threonine, Ser/Thr)蛋白激酶，有A-Raf，B-Raf和Raf-1三种同工酶。MEK为MAP2K家族成员，有MEK1、MEK2 两个亚型，上游的Raf1蛋白激酶被活化后，它的C端催化区能与MEK结合，并使催化区中的Ser和Thr磷酸化，从而激活MEK。活化的MEK能够磷酸化酪氨酸/苏氨酸 (tyrosine/threonine, Tyr/Thr)残基，其作用是磷酸化并激活下游底物 ERK1/2，从而影响细胞生长、增殖和分化[14-15]。其中，ERK是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。ERK1/2也是多种细胞外信号（激素、细胞因子、生长因子等）引起细胞增殖与分化信号转导的共同通路或汇聚点[16]。研究证实，磷酸化的ERK1/2活性升高可刺激Caco2/15细胞株在体外的增生，当增生到一定程度后，ERK1/2活性逐步降低，细胞增殖停止转向分化，这表明ERK1/2是胃肠道细胞分化过程的重要调节因子[17]。李铁浪等[18]研究表明，艾灸通过激活三叶因子( trefoil factor，TFF)/ERK 信号转导通路，促进脾虚胃溃疡大鼠损伤胃黏膜的增殖修复。

      本研究结果显示，大黄水浸剂灌胃14 d后，大鼠体质量增长缓慢，食量下降，活动减少，喜蜷卧，大便溏泄，毛色不泽，提示造模成功。采用雷尼替丁和隔药饼灸干预后，大鼠食欲增强，活动增加，精神状况明显改善，粪质好转，毛发改善，说明两种干预方法均能改善脾虚表现。治疗结束后再次使用消炎痛灌胃是为了强化模型，以防大鼠模型胃黏膜自愈导致实验误差。在大鼠脾虚证造模成功并应用消炎痛后，B组大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达升高，说明大鼠胃黏膜受损后有一定的自我修复功能，激活了MEK/ERK信号转导通路，并启动了胃黏膜的重建和修复。与B组比较，C组和D组大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白进一步升高，由此我们推断在损伤型修复增高的基础上，通过雷尼替丁和隔药饼灸的干预，能进一步上调MEK1/2和ERK1/2蛋白的表达，即修复型增高，提示两种增高方式具有叠加效应，有助于发挥抗消炎痛损伤的作用，进一步促进脾虚证大鼠胃黏膜损伤组织的增殖修复。此外，与C组比较，D组大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达升高，提示隔药饼灸抗消炎痛损伤及促进胃黏膜增殖修复的效应强于雷尼替丁。

       综上所述，隔药饼灸促进脾虚证大鼠胃黏膜的增殖修复，其作用机制可能与提高胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达，激活MEK/ERK信号转导通路相关。

参考文献

[1]李晨,王垂杰.３种脾虚证模型大鼠胃黏膜损伤情况的比较[J].中国中西医结合消化杂志,2013,21(3):127-130.

[2]冯丹,刘静,曲秀娟,等.MEK/ERK 抑制剂影响胃癌细胞对5-FU敏感性及其机制的探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(5):321-324. 

[3]王晨光,杨宗保,左彬荣,等.针刺调节急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜细胞增殖信号通路相关分子的表达[J].中华中医药杂志,2014,29(9):2797-2799. 

[4]易展,常小荣,易受乡,等.从循证医学的角度分析针灸治疗脾胃虚寒证的临床研究概况[J].中华中医药学刊,2010,28(9):1866-1868.

[5]石佳,刘金芝,张国山,等.有烟艾灸、无烟艾灸对急性胃黏膜损伤大鼠血清中SOD、MDA的影响[J].世界华人消化杂志,2013,21(16):1516-1521.

[6]刘密,雷毅军,郭礼娜,等.艾灸预处理对大鼠应激性胃粘膜损伤中保护因子的调节作用[J].中华中医药学刊,2015,33(9):2068-2071.

[7]彭艳,彭芬,易受乡,等.艾灸对脾虚大鼠小肠运动吸收功能及ATP含量的影响[J].中国针灸,2012,32(3):246-250.

[8]李忠仁.实验针灸学[M].2版.北京:中国中医药科技出版社,2007:253.

[9]赵盛云,姜巍,王垂杰.脾虚与胃黏膜屏障功能[J].中国中西医结合消化杂志,2012,20(11):523-525.

[10]常小荣,刘密,严洁,等.艾灸温通温补效应的作用机制及其规律研究[J].世界中医药,2013,8(8):875-879.

[11]赵盛云,王垂杰.四君子汤对脾虚证大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡及Caspase-3表达的影响[J].中国医科大学学报,2014,43(1):31-33.

[12]林亚平,易受乡,吴芳,等.神阙穴隔药饼灸对应激大鼠胃黏膜损伤的作用[J].中国临床康复,2005,9(15):138-139.

[13]高欣,张振玉,吴海露,等.莫沙必利对阿司匹林致大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用[J].胃肠病学,2012,17(9):550-554.

[14]郭海,吉福志,赵晓峰,等.贝母素乙对肺纤维化大鼠肺组织MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化的影响[J].南京中医药大学学报，2016,32(3):170-175.

[15]刘晓玲,王汝俊,付铨盛.补中益气汤对脾虚大鼠胃粘膜MEK/ERKmRNA表达的影响[J].中药药理与临床,2013,29(1):5-8.

[16]张泓,郭华,张雨辰,等.艾灸对脾虚胃溃疡模型大鼠胃组织表皮生长因子受体、磷酸化细胞外信号调节激酶的影响[J].针刺研究,2014,39(5):351-357. 

[17]Aliaga J C, Deschenes C, Beaulieu JF, et al．Requirement of the MAP kinase cascade for cell cycle progression and differentiation of human intestinal cells[J]. Am J Physiol, 1999, 277(3 Pt 1):G631-G641. 

[18]李铁浪,粟艳梅,祁芳,等.艾灸对脾虚胃溃疡模型大鼠血清TFF及胃黏膜ERK1/2、PCNA的影响[J].湖南中医药大学学报，2015,35(2):49-51.