王　珂¹，曾　亮²，周伊人¹，周映帆²，赵　冉²，杨丽萍²，侯文光²

（1上海中医药大学附属曙光医院针刺麻醉研究所，上海 201203；2上海中医药大学附属岳阳医院，上海 200437）

摘要：目的：观察电针对慢性神经痛大鼠海马区域高迁移率族蛋白1（HMGB1）及其下游效应促炎细胞因子的影响，探讨电针镇痛的作用机制。方法：将Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，每组12只。结扎大鼠坐骨神经建立坐骨神经慢性压榨性损伤（CCI）模型。电针双侧“足三里”“阳陵泉”，每日1次，共7d。观察各组大鼠机械痛域（MTW），采用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测海马高迁移率族蛋白1（HMGB1）mRNA和蛋白的表达水平，同时采用ELISA法检测海马区域肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）的表达水平。结果：与假手术组比较，模型组MTW显著减少（P < 0.001）。与模型组比较，电针3d和7d后，电针组MTW显著上调（P < 0.05，P < 0.01）。与假手术组比较，模型组大鼠海马区域HMGB1基因及蛋白表达水平显著增加（P < 0.001），同时TNF-α和IL-1β蛋白表达水平均显著升高（P < 0.001）。电针7d后，与模型组比较，电针组海马区域HMGB1基因及蛋白表达（P < 0.001，P < 0.01）及其上述2个促炎细胞因子蛋白表达水平均降低（P < 0.05）。结论：电针可明显改善慢性神经痛大鼠疼痛，其改善效应可能与抑制大鼠海马HMGB1及其下游促炎细胞因子释放有关。

关键词：针灸；电针镇痛；慢性神经痛；海马；高迁移率族蛋白1

Effect of Electroacupuncture on Expression of High Mobility Group Protein 1 in the Hippocampus in Rats with Chornic Neuropathic Pain

WANG Ke¹，ZENG Liang²，ZHOU Yiren¹，ZHOU Yinfan²，ZHAO Ran²，YANG Liping²，HOU Wenguang²

(1Research Institute of Acupuncture Anesthesia，Shu Guang Hospital Affiliated to the Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，2Department of Acupuncture-Moxibustion，Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China)

Abstract: Objective: To observe the effect of electroacupuncture (EA) on expression of High Mobility Group Protein 1 (HMGB1) and related downstream effectors of proinflammatory cytokines in the hippocampus in chronic neuropathic pain rats, so as to investigate the mechanism of EA analgesia. Methods: Male Sprague-Dawley rats were randomized into sham group, model group, and EA group, with 12 rats in each group. The chronic constriction injury (CCI) model was established by ligation of the left sciatic nerve. EA was applied to bilateral “Zusanli”(ST 36) and “Yanglingquan”(GB 34) for 30 min, once daily for 7 days. The withdrawal mechanical threshold (WMT) was detected in left hind paw. The expression level of HMGB1 in the hippocampus was determined using quantitative RT-PCR and western blotting, and the content of TNF-α and IL-1β were detected by ELISA. Results: Compared with the sham group, the MWT values at different time point were decreased markedly after modeling (P < 0.001). After EA intervention for 3 and 7 days, the MWT values were up-regulated in EA group (P < 0.05, P < 0.01).  Compared with the sham group, the mRNA and protein expression levels of HMGB1 were increased markedly (P < 0.001), while the protein expression levels of TNF-α and IL-1β were also up-regulated (P < 0.001). After EA intervention, the levels of HMGB1 mRNA and protein expression were notably down-regulated in the EA group than in the model group (P < 0.001, P < 0.01), while the levels of TNF-α and IL-1β were also significantly down-regulated (P < 0.05). Conclusion: EA stimulation can relieve the chronic neuropathic pain, which may be related with inhibition of HMGB1 and associated downstream effectors of proinflammatory cytokines in the hippocampus.

Key words: Acupuncture and moxibustion, Electroacupuncture analgesia, Chronic neuropathic pain, Hippocampus, High Mobility Group Protein 1

      神经病理性痛（neuropathic pain，NP）是由于躯体感觉神经系统的损伤或疾病所引起的一种慢性疼痛，以自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏为主要临床特征，严重影响患者的生活质量[1]。作为大脑边缘系统的重要组成部分，海马参与了痛觉相关信息的感知和调制[2-3]。临床实践和实验研究表明，针刺治疗对NP具有较好的治疗作用[4-5]。同时已有的研究提示海马是针刺治疗病理性疼痛的重要中枢神经区域效应靶器官[6-7]，但针刺如何通过调节海马达到治疗NP的作用机理尚不明确，有待阐述。

      近年来研究发现高迁移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）参与疼痛中枢敏化的形成，在痛觉信息传递和调制中发挥重要作用[8]。HMGB1是一个高度保守、在大多数细胞类型中广泛表达，含有215个氨基酸残基的单链多肽。HMGB1是一种强有力的炎症介质，诱导和放大炎性反应，HMGB1可通过级联反应引起肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）等促炎细胞因子的大量增加和分泌[9]。已有的研究表明反神经损伤后促炎细胞因子的大量上调在神经病理性疼痛的发生发展中起关键作用[10]。因此，本实验拟通过观察低频电针对慢性神经结扎性损伤（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI）造成的慢性神经病理性大鼠模型，观察低频电针是否通过对海马HMGB1及其下游促炎细胞因子表达的影响，探讨电针治疗NP的可能机制。

1　材料与方法

1.1 实验动物及分组

      成年雄性SPF级SD大鼠36只，体质量约240~260 g，由上海市斯莱克公司提供。动物使用许可证号：SCXK（沪）2012-0002。大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，每组12只。大鼠自由进食饮水，每年光照12 h。实验过程中对动物的处理严格遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。实验前3d，对大鼠进行人为操作适应性训练。

1.2 主要试剂和仪器

       主要试剂：戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）；TRIzol试剂（Invitrogen公司）；反转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒（Takara公司）；蛋白抽提试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；HMGB1一抗抗体（Abcam公司）；大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）。

        主要仪器：华佗牌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司），电针仪（上海医用电子仪器厂，型号：G6805-2）；机械痛电子测试仪（IITC公司，美国）；NanoDrop 2000（Thermo Scientific公司，美国）；荧光定量PCR仪（ABI7900，Applied Biosystems，美国）蛋白电泳仪（Bio-Rad，美国）；Chemiscope 2950型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；Image-Pro Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）；多功能酶标仪（Bio-Tek公司，美国）。

1.3 模型制备

      根据文献报道[11]，并结合本课题组前期研究报道的方法[5, 7]，简要步骤如下：大鼠用戊巴比妥钠40 μg/g腹腔注射麻醉，钝性分离并暴露左侧股骨中段坐骨神经，以4-0 缝合线间隔约1 mm 结扎4道，结扎以左后趾轻微抽动为度。假手术组仅进行分离坐骨神经的操作，不结扎坐骨神经。

1.4 电针干预方法

      根据《实验针灸学》，选取大鼠双侧“足三里”“阳陵泉”穴。将大鼠固定在特制的固定架上，暴露后肢，将毫针分别直刺插入大鼠双侧穴位，连接电针治疗仪给予通电刺激。电针参数为2Hz 30min，刺激强度逐级增加，0.5 ～ 1.0 ～ 1.5 mA，每种强度持续10 min，1次/d，从造模后第7天开始连续7天。假手术组和模型组大鼠进行相同固定，但不予针刺处理。

1.5 检测指标与方法

机械痛阈测定：各组大鼠在造模前1d进行足底机械痛阈（mechanical withdrawal threshold，MWT）测定，作为基础痛阈值。造模后第7开始给予电针刺激，电针第1、3、7d后，分别测定动物的机械痛阈。测量前，将大鼠置于痛阈测试网上适应环境10 min。待大鼠安静后，采用机械痛电子测试仪探头刺激大鼠后足足底中央，记录大鼠产生缩退反应时候的压力数值作为阈值。

取材：第7天测试结束后，各组大鼠腹腔注射深度麻醉后，迅速分离海马组织，用锡纸包裹迅速冻于液氮中，然后转移至- 80℃冰箱中保存备用。

定量Q-PCR法检测海马HMGB1 mRNA的表达：采用TRIzol试剂及方法进行样本RNA提取，测定RNA浓度和纯度，后进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。取1 μg的mRNA反转录成cDNA，以此为模板采用定量Q-PCR方法检测目的基因HMGB1的表达。HMGB1引物上游序列5’— AGAAGTGCTCAGAGAGGTGG—3’，下游序列5’— CTTTGGGGGGGATGTAGGTT—3’，内参Gapdh引物上游序列5’— TCCTGCACCACCAACTGCTTAG—3’ ，下游序列5’—AGTGGCAGTGATGGCATGGACT—3’。定量Q-PCR实验数据结果采用2-△△Ct进行分析。

       Western blot法检测HMGB1蛋白表达：取冻存的海马组织加入蛋白裂解液，冰浴匀浆，提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。每个样本取20 μg蛋白上样，12%，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，分别加入一抗HMGB1（稀释浓度1:1000）和Gapdh（稀释浓度1:5000），4℃脱脂奶粉孵育过夜，加二抗，曝光。免疫印迹图像采用Image-Pro Plus图像分析软件进行分析。

       ELISA法测定海马区TNF-α和IL-1β含量：按照Western blot方法中提取出来的组织蛋白样品，严格按照TNF-α和IL-1β的ELISA试剂盒中的实验步骤对各样品进行检测。

1.6 统计学分析

       采用SPSS 19.0进行数据分析，行为学数据用均数±标准误（±sx）表示，其它数据用均数±标准差（±s）表示。MWT数据采用重复测量的方差分析，其它检测数据采用单因素方差分析，继以Tukey进行两两比较。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠患侧MWT值比较

       图1可见，造模前各组大鼠MWT无统计学差异（P > 0.05）。与假手术组比较，造模后，模型组和电针组MWT阈值显著减少（P < 0.001）。与模型组比较，电针组3和7d后MWT显著增加（P < 0.05，P < 0.01）。

2.2 各组大鼠海马HMGB1基因和蛋白表达的比较

       图2和图3结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠海马HMGB1的基因和蛋白的表达明显表达上调（P < 0.001）。电针后，与模型组相比，电针组HMGB1基因和蛋白的表达均明显表达降低（P < 0.001，P < 0.01）。

图2 各组大鼠海马HMGB1基因相对表达量（±s，6只/组）

注：与假手术组比较，*** P < 0.001；与模型组比较，&&&P < 0.001

2.3 各组大鼠海马TNF-α和IL-1β含量的比较

图4A和4B结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠海马TNF-α和IL-1β的表达明显表达上调（P < 0.001）。电针后，与模型组相比，电针组TNF-α和IL-1β的表达均明显表达降低（P < 0.05）。

3 讨论

       本研究结果显示，大鼠CCI造模后机械痛阈值明显降低，痛敏增加，而电针治疗能显著抑制CCI大鼠机械性痛觉过敏行为，说明电针能有效缓解神经病理性疼痛，与以往研究报道结果相似[12]。

炎症反应与神经病理性疼痛的发生、发展密切相关[13]。近年来研究发现，外周神经损伤导致神经病理性疼痛时，TNF-α会在海马区域大幅增加，将含有TNF-α基因特异性小干扰RNA金纳米棒基因载体注入海马能够有效减少TNF-α的水平，同时能有效缓解神经病理性疼痛大鼠的痛敏行为[14,15]。同样，研究证实海马IL-1β的mRNA水平与神经病理性疼痛行为程度高度相关[16]。而本次实验结果同样表明神经病理性疼痛大鼠海马区域的TNF-α和IL-1β水平升高，而电针处理可抑制神经病理性疼痛大鼠海马区域TNF-α和IL-1β的异常增高，从而发挥镇痛效应治疗神经病理性疼痛。

       以往的研究已经表明HMGB1自分泌或被动释放至细胞外时，主要通过与受体晚期糖基化终末产物受体[17]、Toll样受体[18]结合诱导促炎性细胞因子的产生和分泌，诱导启动和放大促进炎症反应，发挥炎症反应中发挥中心环节的作用[9]。近年来研究发现，无论是皮下注射HMGB1至足跖侧，或者是直接在踝关节内注射HMGB1，均能引起小鼠的机械痛敏反应，提示HMGB1与疼痛密切相关。进一步研究发现神经病理性疼痛时，脊髓和背根神经节区域HMGB1表达上调[19,20]。与此同时，在脊髓阶段，发现CCI模型大鼠脊髓HMGB1的mRNA和蛋白表达显著升高的同时伴随TNF-α和IL-1β水平的增高[21]。通过鞘内注射HMGB1中和性抗体能够有效缓解糖尿病周围神经痛的机械痛敏，同时能够抑制脊髓阶段TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子mRNA的异常增高[22]。这些结果提示HMGB1及其介导的下游促炎细胞因子的释放在神经病理性疼痛中扮演重要的角色。而针刺治疗其他疾病时，已发现电针可通过有效调节HMGB1达到治疗疾病的作用，是电针的潜在效应物质之一[23,24]。本研究结果显示，电针干预可在一定程度上下调CCI神经病理性疼痛大鼠海马区域HMGB1、TNF-α和IL-1β表达的异常增高，提示电针可能是通过抑制海马区域HMGB1及其下游效应促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的合成和释放发挥镇痛效应，从而达到治疗神经病理性疼痛的作用。

       综上所述，电针可以改善神经病理性疼痛大鼠的痛觉行为反应。电针效应可能与抑制神经病理性疼痛大鼠海马HMGB1及其下游信号相关效应促炎细胞因子水平有关。本研究阐释了电针治疗神经病理性疼痛的部分机制，同时也为电针治疗神经病理性疼痛提供了科学依据，其机制仍需进一步研究。

参考文献

[1] Toth C, Lander J, Wiebe S. The prevalence and impact of chronic pain with neuropathic pain symptoms in the general population [J]. Pain Med, 2009, 10(5): 918-929.

[2] Mutso A, Petre B, Huang L, et al. Reorganization of hippocampal functional connectivity with transition to chronic back pain [J]. J Neurophysiol, 2014, 111(5): 1065-1076.

[3] Ren WJ, Liu Y, Zhou LJ, et al. Peripheral nerve injury leads to working memory deficits and dysfunction of the hippocampus by upregulation of TNF-alpha in rodents [J]. Neuropsychopharmacology, 2011, 36(5): 979-992.

[4] 邱玲，胡小丽，赵学宇，等. 针刺坐骨神经干治疗腰椎间盘突出症所致坐骨神经痛的疗效观察[J]. 针刺研究，2016，41(5)：447-450，473.

[5] Ju Z, Cui H, Guo X, et al. Molecular mechanisms underlying the effects of acupuncture on neuropathic pain [J]. Neural Regen Res, 2013, 8(25): 2350-2359.

[6] 阚宇，陈淑萍，高永辉，等. 海马一氧化氮/蛋白激酶G信号通路参与针刺对慢性痛大鼠产生的累积性镇痛效应[J]. 针刺研究，2013，38(2)：93-99.

[7] 王珂，具紫勇，郭现辉，等. 针刺对慢性神经痛大鼠海马EphrinBs /EphBs mRNA 和EphrinB3蛋白表达的影响[J]. 上海中医药大学学报，2014，28(3)：79-82.

[8] Wan W, Cao L, Khanabdali R, et al. The Emerging Role of HMGB1 in Neuropathic Pain: A Potential Therapeutic Target for Neuroinflammation [J]. J Immunol Res, 2016, 2016: 6430423.

[9] Magna M, Pisetsky DS. The role of HMGB1 in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases [J]. Mol Med, 2014, 20: 138-146.

[10] Lees JG, Fivelman B, Duffy SS, et al. Cytokines in Neuropathic Pain and Associated Depression [J]. Mod Trends Pharmacopsychiatry, 2015, 30: 51-66.

[11] Wei F, Xu ZC, Qu Z, et al. Role of EGR1 in hippocampal synaptic enhancement induced by tetanic stimulation and amputation [J]. Cell Biol, 2000, 149(7): 1325-1334.

[12] 端木程琳，冯秀梅，闫娅霞，等. 电针对慢性痛负性情绪大鼠杏仁核神经突触可塑性相关蛋白／基因表达的影响[J]. 针刺研究，2017，42(1)：1-8.

[13] Zhang J, Echeverry S, Lim TK, et al. Can modulating inflammatory response be a good strategy to treat neuropathic pain? [J]. Curr Pharm Des, 2015, 21(7): 831-839.

[14] Liu Y, Zhou LJ, Wang J, et al. TNF-α Differentially Regulates Synaptic Plasticity in the Hippocampus and Spinal Cord by Microglia-Dependent Mechanisms after Peripheral Nerve Injury [J]. J Neurosci, 2017, 37(4): 871-881.

[15] Gerard E, Spengler RN, Bonoiu AC, et al. Chronic constriction injury-induced nociception is relieved by nanomedicine-mediated decrease of rat hippocampal tumor necrosis factor [J]. Pain, 2015, 156(7): 1320-1333.

[16] del Rey A, Yau HJ, Randolf A, et al. Chronic neuropathic pain-like behavior correlates with IL-1β expression and disrupts cytokine interactions in the hippocampus. Pain, 2011, 152(12):2827-2835.

[17] Allette YM, Due MR, Wilson SM, et al. Identification of a functional interaction of HMGB1 with Receptor for Advanced Glycation End-products in a model of neuropathic pain [J]. Brain Behav Immun, 2014, 42:169-177.

[18] Ma YQ, Chen YR, Leng YF, et al. Tanshinone IIA Downregulates HMGB1 and TLR4 Expression in a Spinal Nerve Ligation Model of Neuropathic Pain [J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2014, 2014: 639563.

[19] Feldman P, Due MR, Ripsch MS, et al. The persistent release of HMGB1 contributes to tactile hyperalgesia in a rodent model of neuropathic pain [J]. J Neuroinflammation, 2012, 9: 180.

[20] He Z, Guo Q, Xiao M, et al. Intrathecal lentivirus-mediated transfer of interleukin-10 attenuates chronic constriction injury-induced neuropathic pain through modulation of spinal high-mobility group box 1 in rats [J]. Pain Physician, 2013, 16(5): E615-625.

[21] Kuang X, Huang Y, Gu HF, et al. Effects of intrathecal epigallocatechin gallate, an inhibitor of Toll-like receptor 4, on chronic neuropathic pain in rats [J]. Eur J Pharmacol, 2012, 676(1-3): 51-56.

[22] Ren PC, Zhang Y, Zhang XD, et al. High-mobility group box 1 contributes to mechanical allodynia and spinal astrocytic activation in a mouse model of type 2 diabetes [J]. Brain Res Bull, 2012, 88(4):332-337.

[23] 张泓，吴金峰，祁芳，等. 电针下合穴对急性胃黏膜损伤模型大鼠HMGB1及nArhRα7的对比研究[J]. 针刺研究，2016，36(10)：1071-1076.

[24] Zhang J, Yong Y, Li X, et al. Vagal modulation of high mobility group box-1 protein mediates electroacupuncture-induced cardioprotection in ischemia-reperfusion injury [J]. Sci Rep, 2015, 5: 15503.