宋小鸽，蔡兴慧，吴生兵，  侯晓蓉，  张  阳，张利达，张荣军

（1 安徽中医药大学针灸经络研究所  合肥  230038；2 安徽中医药大学第二附属医院合肥  230061；3 安徽省立医院南区康复科，合肥 230036）

1 研究背景

      药物成瘾既影响个人健康又威胁到社会的稳定和发展。 药物成瘾属慢性复发性脑病，研究如何干预、保护或修复海洛因脑损伤及其作用机制研究，值得关注。针刺干预海洛因脑损伤在防治药物成瘾研究领域中具有特色。已有大研究表明，海洛因成瘾对脑组织具有慢性损害,其中神经元凋亡是海洛因成瘾致脑神经元损伤的主要形式。那么，复吸海洛因是否可引发脑组织细胞凋亡？观察针刺对未折叠蛋白反应，是否可以阐述针刺干预海洛因脑损伤的可能机制？研究如何干预、保护或修复海洛因脑损伤及其作用机制研究，具有重要的现实意义。

2 研究方法

      本研究以脑海马、 VTA  为观察点，以未折叠蛋白反应通路为切入点，提出"调节未折叠蛋白反应是针刺干预海洛因脑损伤的作用机制之一"的假说。依照建立海洛因成瘾大鼠模型的方法，连续递增量肌肉注射海洛因为染毒。染毒后停止肌肉注射海洛因，为自然戒断（戒断）。 按染毒（成瘾）→戒断的方法， 周而复始反复三个阶段 （染毒→戒断→染毒→戒断→染毒→戒断） 建立海洛因复吸大鼠模型。设正常组、对照组、针刺组、美沙酮组，观察针刺百会、大椎穴对海洛因复吸大鼠海马、VTA  超微结构的影响，运用未折叠蛋白应答功能基因芯片探寻针刺干预海洛因脑损伤起效基因，运用 RT -qPCR、Western blout 和免疫组化等分子生物学技术对分子伴侣和折叠蛋白  GRP78、 CRT，跨膜感受蛋白  IRE1、PERK  等部分关键基因、及泛素和蛋白酶做验证性检测。

3 结果与讨论

      研究发现复吸海洛因导致神经元细胞凋亡增加，表明海洛因对脑组织具有损伤作用。针刺百会、大椎抑制细胞凋亡，为针刺干预海洛因脑损伤提供了形态学依据（图略）。CHOP  表达升高是内质网应激反应的标志。我们的研究表明，针刺可抑制复吸海洛因成瘾大鼠内质网应激反应的标志蛋白 CHOP 的表达，促进内质网应激反应的标志性分子伴侣蛋白 GRP78 表达，调控内质网应激，从而起到保护神经损伤作用。进一步观察发现，海马、VTA  脑区  CRT、GRP78  表达量明显低于正常大鼠，表明注射海洛因具有抑制  CRT、GRP78  表达的作用（图略），这对维持细胞内质网内稳态， 促进未折叠蛋白折叠， 阻止细胞凋亡不利。 针刺“百会”、 “大椎”穴可抑制神经细胞凋亡，增加  CRT、GRP78  表达，有利于快速与转运入内质网管腔的新合成蛋白结合，参与新蛋白的折叠、寡聚化、成熟等翻译后修饰过程，帮助未折叠蛋白形成具有活性的功能性蛋白，转移至高尔基体，防止未折叠和（或）错误折叠蛋白质的输出，对细胞生存起到促进作用。针刺调控  GRP78  表达在针刺干预海洛因脑损伤作用机制研究中首次报告。经未折叠蛋白反应芯片检测发现，复吸海洛因大鼠海马  HSP70、HSP105  和  Vcp  下调，而针刺改变HSP70、HSP105  和  Vcp  的下调（图略），通过提高内质网折叠能力，调控复吸海洛因大鼠未折叠蛋白反应起到抑制细胞凋亡的效应，减少海洛因复吸大鼠脑神经细胞凋亡，发挥干预脑损伤的作用。首次阐释了针刺干预海洛因脑损伤作用与未折叠蛋白反应有关的起效基因。

      基于从泛素-蛋白酶体途径，观察海洛因复吸大鼠脑  Ub、E3、26S  的变化，对  UPR  通路的蛋白降解中的部分主要关键基因加以检测分析，探讨针刺通过调控蛋白降解干预海洛因脑损伤的分子机制。发现针刺百会、大椎穴后，大鼠中枢神经细胞凋亡减少，VTA 和海马中 Ub、E3，26S 表达下降（图略），提示中枢神经损伤受到抑制，体内异常蛋白量下降，细胞趋于自身稳态。 中医认为，脑主管精神意识思维活动。而海洛因可以引起人体各系统的损害，尤以脑部损害较为多见，主要表现为意识、精神障碍、抽搐发作等。督脉循行于脊里，入络于脑，且督脉多主神志病，百会、大椎为督脉本经穴，百会穴位于巅顶部，其深处即为脑之所在，现代研究也发现百会穴浅表分布着丰富的血管和神经，如枕大神经、额神经分支，深层有大脑皮质运动区和旁中央小叶，因此刺激百会穴对改善中枢神经的功能及血液循环有直接调节作用；大椎穴为手足三阳经与督脉的交会穴，其内可通行督脉，外可游走三阳。针刺督脉百会、大椎穴其功效为可以振奋全身之阳气，疏通经络、健脑补髓、醒脑开窍，具有促进脑神经康复之功效。通过调控参与蛋白质折叠、内质网降解途径等神经营养因子、泛素化、热休克蛋白等物质的活性，增加分子伴侣  HSP70、HSP105  和  Vcp 表达，来提高内质网折叠能力，减少海洛因复吸大鼠脑神经细胞凋亡，这可能是针刺百会、大椎穴

干预干预海洛因复吸大鼠脑损伤的作用机制之一。本项研究为针刺干预海洛因脑损伤的作用提供形态学的依据，首次阐释了针刺干预海洛因脑损伤作用与未折叠蛋白反应有关的起效基因，针刺调控分子伴侣和折叠蛋白  GRP78、CRT，跨膜感受蛋白IRE1、PERK  等表达的效应，从细胞、蛋白、基因水平，阐释针刺通过调控内源性生物活性物质起到干预保护海洛因脑损伤的作用机制，在针刺干预海洛因脑损伤作用机制研究中首次报告。本项研究既为针灸戒毒康复提供了科学依据，丰富了针灸理论，又促进了针灸戒毒康复的临床应用。